应用套式RT-PCR方法检测文山州疑似猪瘟的病例报告

吴孟洁，赵敏，朱玲云，张绍卫，唐清，陈瑞雪

(1.文山州动物疫病预防控制中心，云南 文山 663099；2.云南省兽医生物制品研制中心，云南 保山 678000)

猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒(Infectionwithclassicalswinefevervirus，简称CSFV)引起的一种急性、发热、接触性传染病，具有高度传染性和致死性。本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生，是威胁养猪业的主要传染病之一[1]。疫苗免疫是猪瘟防控的重要策略之一。

猪瘟病毒属黄病毒科猪瘟病毒属，是一种RNA病毒。猪瘟因与高致病性猪蓝耳病等疾病在临床上表现得非常相似，使鉴别诊断难度增大。为了能快速、准确诊断猪瘟病毒，结合文山州基层兽医实验室的检测水平，运用国内较为成熟的PCR技术，建立了CSFV套式PCR检测方法，为快速诊断与预防猪瘟提供重要技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒和样品

1.1.1病毒

CSFV阳性样本、PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)阳性样本和PCV(猪圆环病毒)阳性样本均由云南省动物疫病预防控制中心惠赠，贮存于文山州动物疫病预防控制中心PCR实验室-79 ℃超低温冰箱。

1.1.2样品

发病猪病死后病理解剖时以出血性病变为主，全身淋巴结肿胀，扁桃体、脾脏、淋巴结有出血点。

采集发病猪和健康猪的扁桃体、脾脏和淋巴结3个部位，采集文山州8个县(市)大型规模养殖场疑似猪瘟病料共10份，贮存于文山州动物疫病预防控制中心PCR实验室-79 ℃独立冰箱。

1.2 主要试剂

AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒、95%无水乙醇、异丙醇、冰乙酸、西班牙琼脂糖、TAE电泳缓冲液、1×PBS液、TaKaRa PrimeScriptTMOne-Step RT-PCR试剂盒、TaKaRa Premix Taq Enzyme、TaKaRa Marker DL-1000或DL-2000。

猪瘟病毒引物由云南省动物疫病预防控制中心惠赠(参照GB/T 36875—2018)。见表1。

表1 猪瘟病毒套式RT-PCR引物序列

1.3 方法

1.3.1样品的制备

将发病猪和健康猪的扁桃体、脾脏、淋巴结等病料研磨后，用0.85%生理盐水稀释，10000r/min，离心2～3min后收集上清液，备用。

1.3.2检测样品总RNA的提取

采用AxyPrep病毒DNA/RNA试剂盒提取。

1.3.3实验室CSFV套式PCR扩增

以获得的总RNA为模板进行第一轮一步法扩增。反应体系(50μL)：2×1 Step Buffer 20μL，PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 1.5μL，外套上下游引物各1μL，RNA模板1.5μL，用RNase-free Water补至50μL。反应扩增程序为：50℃反转录30min，94℃预变性2min；95℃变性15s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

以第一轮扩增后的PCR产物为模板进行第二轮PCR扩增。反应体系(50μL)：Premix Taq Enzyme 25μL，内套上下游引物各1μL，第一轮PCR产物1.5μL，用RNase-free Water补至50μL。反应扩增程序为：94℃预变性2min；95℃变性15s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取10μL第二轮PCR产物进行1%琼脂糖电泳后，凝胶成像系统中照像观察。

2 结果

2.1 CSFV套式PCR检测方法特异性实验

用所建立的方法对CSFV、PRRSV和PCV阳性样本进行扩增，结果只有CSFV阳性样本扩增出272bp的目的条带，与预期条带大小一致，阴、阳性对照均成立，说明所建立的方法是特异的(见图1)。

2.2 样品中CSFV的检测

用所建立的方法对发病猪和健康猪的扁桃体、脾脏和淋巴结的核酸进行扩增，结果只有发病猪的扁桃体、脾脏和淋巴结扩增出272bp的目的条带，与预期条带大小一致，阴、阳性对照均成立，说明所建立的方法成立(见图2)。

M.DL-2000 DNA Marker；1.阳性对照；2.阴性对照；3-5.发病猪的扁桃体、脾脏和淋巴结扩增产物；6-8.健康猪的扁桃体、脾脏和淋巴结扩增产物。

2.3 检测方法的应用

对10份疑似猪瘟病料进行检测，CSFV阳性4份，阴性6份，扩增结果见图3。

M.DL-1000 DNA Marker；1.阳性对照；2.阴性对照；3-12.病料扩增产物。

3 讨论

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种急性、高度接触性的致死性传染病，因与高致病性猪蓝耳病等疾病在临床上表现得非常相似，一定程度上给兽医临床诊断造成很大困难。为此，早期鉴别诊断并及时了解发病状况对控制猪瘟的流行尤为重要。PCR方法现已经成为动物疫病检测较为理想的方法，其快速、敏感、特异的优点为动物疫病早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。使用套式PCR(Nest-PCR)是在PCR的基础上，利用第二套特异性引物扩增第一次反应生成的PCR产物的“亚片段”，可使检测结果更具有特异性和敏感性。

目前文山州8个县(市)已有7个兽医实验室可开展分子生物学检测，将该方法运用到兽医诊断中，大大节约了检测时间，更好地为养殖户提供诊断和治疗建议，从而减少了猪瘟对养猪业造成的损失。

文山州地处云南省东南部，其南部的马关、麻栗坡、富宁3县的15个乡(镇)与越南接壤，国境线长达438km，有边境通道116条，东部的丘北、广南、富宁3县的16个乡(镇)与广西、贵州相连，边界线长675km。若想有效提升防疫工作，防止猪瘟病毒跨境、跨界和本地流行，除了要严格疫苗的运输与储藏外，还要确保疫苗管理与使用的科学性。基层动物防疫部门除了定期向村兽医进行业务培训，做好猪群的猪瘟免疫抗体监测，并及时补免外，还要向养殖户宣传严禁违规调运、贩卖和丢弃病死猪。