5种提取方法对铁棍山药多糖得率和抗氧化活性的影响

冯斌，王君鹏，周盼盼，史继祖

1.北京科技大学天津学院（天津 301830）；2.吉林体育学院国家体育总局耐力项目重点实验室（长春 130022）

山药（Dioscorea oppositeThunb.）属于植物薯蓣的块茎，可食药两用，在中国主要产自辽宁、内蒙、安徽、山东、河南和江西等地[1-3]。在医学中山药被认为具有补脾养胃、生津益肺等功效[4]。研究表明山药含有多糖、皂苷、多酚、甾醇等多种生物活性物质，具有降血糖、增强免疫力、降血脂、抗肿瘤、抗疲劳、抗衰老和抗氧化等功能，其中山药多糖被认为是最重要的活性成分之一，山药多糖在医药和保健领域拥有良好的应用前景[5-8]。

山药多糖一般的提取方法为水提醇沉法，近年来，开发出很多新的提取山药多糖的方法，如微波提取法、酶剂提取法和超声波提取法等[9-15]。山药多糖结构较复杂，多糖的生物活性与其结构密切相关，采用不同提取方法均可能会引起多糖获得率、成分及生物活性的变化[5]。然而有关提取方法对铁棍山药多糖抗氧化活性影响的报道不多[5]，这在一定程度上制约山药活性多糖的应用。以铁棍山药为研究对象，选用水提醇沉法、微波法、超声波法、酶法及微波-酶法分别提取山药多糖并考察不同提取方法获得多糖的抗氧化性能，不同提取方法的最佳工艺由实验室前期筛选获得。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山药（购于中药材市场）；羟基自由基试剂盒、超氧阴离子试剂盒（某生物科技有限公司）；无水乙醇、葡萄糖等（分析纯，天津市某化学试剂有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）；纤维素酶、α-淀粉酶（江苏锐阳生物技术有限公司）。

1.2 仪器与设备

超声波清洗机；匀浆机；电子天平；水浴锅；722S分光光度仪；干燥箱；PJ23C-SC1美的微波炉；Pilot2-4LD冷冻干燥机；H1850离心机；RE-52A旋转蒸发器。

1.3 方法

1.3.1 铁棍山药多糖的提取工艺流程

挑选山药外形完整铁棍山药，先用清水冲洗表面，去除外皮后，将山药切成约2 mm的薄片，为防止山药褐变，可用0.1%柠檬酸和0.02% VC溶液进行护色处理30 min。将护色后的山药进行冷冻处理，研磨成粉，过0.180 mm孔径筛备用。在前期工作基础上，采用各提取方法的最优工艺来提取山药多糖，其工艺流程如下所示。

1）水提醇沉法：料液比1∶9（g/mL）、提取温度80 ℃、提取时间240 min。2）微波辅助提取法：微波功率650 W、微波时间60 min、料液比1∶12（g/mL）。3）超声辅助提取法：料液比1∶28（g/mL）、超声功率600 W，超声时间90 min、超声温度75 ℃。4）微波-酶剂协同提取法：料液比1∶6（g/mL）、微波功率830 W、提取温度85 ℃、提取时间150 min，酶剂为α-淀粉酶与纤维素酶，酶量0.5 g淀粉和0.05 g纤维素（50 g山药粉末）。5）纤维素酶提取法：酶添加量3%、酶解时间75 min、酶解温度60 ℃、料水比1∶30（g/mL）、0.05 g纤维素（50 g山药粉末）。

取50 g山药粉，分别按照水提法、超声波、微波、纤维素酶和微波-酶法的工艺进行多糖提取。以水提醇沉法为例，按照1∶9（g/mL）料液比混合后，在80 ℃恒温水浴锅中水浴240 min后，在离心机中以8 000 r/min离心15 min后，弃去上清液。将沉淀物经旋转蒸发仪浓缩后，向其中加入80%乙醇进行24 h醇沉，最后离心取沉淀部分进行干燥处理，即可得到山药多糖。铁棍山药多糖得率按式（1）计算。

式中：C为提取液中多糖质量浓度，μg/mL；V为提取液体积，mL；m为铁棍山药粉质量，g。

1.3.2 铁棍山药多糖浓度的测定

使用苯酚-硫酸法测定山药多糖的含量。制备0.1 mg/mL葡萄糖溶液，按照表1分别添加葡萄糖溶液并用蒸馏水定容至2 mL，CK管用于对照调零。在490 nm处测定各管的吸光度，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线y=5.79x-0.021，R2=0.997。

表1 试剂添加量

1.3.3 铁棍山药多糖的抗氧化能力

通过对所提取的铁棍山药多糖进行DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子清除能力的测定[5,16]，得出不同提取方法对铁棍山药多糖抗氧化能力的影响。

2 结果与讨论

2.1 5种提取方法所获得的山药多糖得率

分别采用5种不同的提取工艺进行提取，平行3次，取平均值。5种方法所提取的山药多糖得率如表2和图1所示。相比于水提醇沉法，微波法、超声波法、微波辅助酶法及纤维素酶法均显著提高山药多糖得率，且缩短提取所用时间，表明在提取铁棍山药多糖过程中，破壁是关键。微波-酶剂协同提取法的提取效果最佳，铁棍山药多糖得率为13.83%，相比水提醇沉法提高83.42%，提取的时间也相应缩短90 min。与微波辅助提取法（9.30%）和超声波辅助提取法（8.57%）相比，纤维素酶提取法的多糖得率（11.55%）较高，说明酶剂裂解细胞壁的效率要高于机械式破壁。山药多糖主要储存在细胞内，细胞壁的主要成分为纤维素和果胶等，因此添加单一的酶制剂如纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，或者添加复合酶制剂等均能有效促进细胞壁的裂解，从而有利于多糖释放[14]。微波辅助酶提取法的优点是高效，多糖得率达13.83%，其原理是在酶制剂裂解细胞壁基础上，外加微波能使山药细胞内部的水分等极性物质迅速产生大量热量，产生压力致使细胞破裂，加速多糖成分的溶出、提取[17-18]。

图1 不同提取方法对山药多糖得率的影响

表2 不同提取方法对山药多糖得率的影响

与水提醇沉法相比，微波和超声波辅助法能不同程度地提高多糖得率，但超声波和微波的能量有可能会导致多糖降解，破坏多糖结构，继而会影响山药多糖生物活性[5]。酶法提取过程较温和，但酶剂的使用类别和剂量需要多次筛选，避免不必要的浪费。

2.2 铁棍山药多糖杂质成分的去除

铁棍山药粗多糖的杂质成分主要为蛋白类和酚类物质等。为避免多糖杂质成分对后续试验的影响，利用Sevag法去除山药粗多糖中蛋白类杂质，经8次反复除杂后，通过紫外光谱扫描，确保在波长260和280 nm处无吸收峰，说明铁棍山药多糖无蛋白类杂质。酚类杂质的去除以Folin-Ciocalteu试剂检测为准，试剂检测结果呈现阴性时，表明山药多糖中的无酚类杂质已被去除[4-5]。

2.3 5种提取方法所得山药多糖的抗氧化活性比较

2.3.1 铁棍山药多糖清除DPPH自由基的能力

不同方法提取的山药多糖对DPPH自由基清除的结果如图2所示，其量效关系的相关性较好，均呈现随着铁棍山药多糖浓度增加而表现出更强的清除活性。多糖质量浓度为2 mg/mL时，水提醇沉法、微波辅助法、超声辅助法、微波辅助酶法及纤维素酶法的DPPH自由基的清除能力分别为69.32%，83.11%，82.43%，94.51%和88.21%。纤维素酶和微波辅助酶提取的多糖质量浓度为3.0 mg/mL时，其DPPH自由基的清除能力可达92%以上。

图2 不同提取方法所得铁棍山药多糖的DPPH自由基清除能力

2.3.2 铁棍山药多糖清除·OH的能力

山药多糖分子末端的半缩醛羟基能还原自由基。由图3可知，微波-酶剂协同法提取的多糖具有最强的清除羟基自由基能力，而超声波辅助法提取的多糖呈现最弱的清除能力。在铁棍山药多糖质量浓度为2.0 mg/mL时，水提醇沉法、微波辅助法、超声辅助法、微波辅助酶法及纤维素酶法的·OH清除能力分别为65.01%，75.04%，53.38%，88.56%和87.83%。多糖质量浓度为3.0 mg/mL时，纤维素酶和微波辅助酶提取的多糖对羟基自由基的清除能力约95%。

图3 不同提取方法所得山药多糖的羟基清除能力

2.3.3 铁棍山药多糖清除超氧阴离子的能力

由图4可知，O2-·清除能力随铁罐山药多糖浓度提呈现上升趋势。山药多糖质量浓度为2.0 mg/mL时，水提醇沉法、微波辅助法、超声辅助法、微波辅助酶法及纤维素酶法的超氧阴离子的清除能力分别为68.32%，81.21%，59.87%，85.54%和80.67%。多糖质量浓度为3.0 mg/mL时，纤维素酶和微波-酶剂协同提取法的多糖对O2-·清除能力分别为90.56%和93.43%。其中，微波法、纤维素酶法和微波辅助酶法清除O2-·能力无显著差异（p＞0.05）。

图4 不同提取方法所得山药多糖的超氧阴离子清除能力

3 结果

采用5种方法提取铁棍山药的多糖，其多糖得率由大到小的工艺方法为：微波-酶剂协同提取法＞纤维素酶提取法＞微波辅助提取法＞超声波辅助提取法＞水提醇沉法，其中微波-酶剂协同提取法获得的多糖得率13.83%，纤维素酶提取法获得的多糖得率11.55%，微波辅助提取法获得的多糖得率9.30%，超声辅助提取法获得的多糖得率为8.57%和水提醇沉法获得的多糖得率为7.54%。对5种方法提取的山药多糖的抗氧化性进行测试，结果发现不同方法获得的山药多糖均具有较高抗氧化活性。其中，由微波-酶剂协同提取法获得的多糖具与最强的清除DPPH·、·OH和O2-·能力，多糖浓度3 mg/mL时，清除率分别为DPPH·（96.45%）、·OH（95.32%）和O2-·（93.43%）。

4 结论

微波法和微波-酶剂协同提取法获得的多糖，其二者间的抗氧化性能力无显著差异（p＞0.05）。超声波提取的多糖清除·OH和O2-·的能力不及水提醇沉法获得的多糖，可能是因为在多糖的提取过程中超声波会破坏了多糖的结构，影响多糖生物活性。微波-酶剂协同提取多糖的抗氧化活性大于微波法，是因为淀粉酶和纤维素酶能较温和地裂解山药细胞壁，有利于多糖溶出；微波-酶剂协同提取法和酶法获得多糖的抗氧化活性无显著差异，表明微波虽然能提高多糖的提取量，但其在一定程度上可能会影响山药多糖的生物活性。总体而言，采用酶剂提取多糖，条件较为温和，且能完整保持多糖生物结构，使多糖具有更高效生物活性。除此以外，采用酶法提取时间较短，且所用设备简单，得率（11.0%以上）也较高。常用的酶制剂有淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等，后期试验可针对不同品种的山药，筛选出不同剂量和类别，以期为山药多糖抗氧化活性的应用提供依据。