改良QuEChERS-LC-MS/MS测定药食同源食品苯基吡唑类农药残留

陈婷，闫君，张文，彭涛，吴福祥

兰州市食品药品检验检测研究所（兰州 730050）

中国有着悠久的饮食文化及中医药文化，药食同源食品由于其兼备了独特的营养与保健功效，近年来受到人们的广泛青睐[1-2]。2019年卫建委公布了按照传统既是食品又是中药材的物质目录，从原有101个品种新增至107种[3]，药食同源产品的研发、生产、应用等活动也逐渐成为当今热点话题[4]。

药食同源物质以可食性植物为主，主要通过栽培种植获得。为满足市场的需求，在栽培过程中常盲目滥用禁限用农药防治病、虫害，致使药食同源类植物受到农药污染日益严重。农药残留不仅影响药食同源类产品在国际市场的贸易，更重要的是对人类健康造成威胁[5-6]。苯基吡唑类农药可以有效地杀死各种虫类，曾被广泛地运用到农作物中，其中最常见的苯基吡唑类是丁虫腈、氟虫腈及其代谢物，人体摄入后会严重影响神经系统并且会损伤肝脏、甲状腺等，且产生较为明显的富集现象[7-8]。我国要求自2009年7月1日起，除卫生用、部分旱田种子包衣剂外，停止销售和使用含有氟虫腈成分的农药制剂，欧盟于2013年起对氟虫腈实行限制使用，禁止氟虫腈在食品产业畜禽养殖中使用，因此建立苯基吡唑类农药快速检测方法尤为重要。目前，针对此类农药的检验方法较少，2015版《中国药典》通则2341《农药残留测定法》中只针对氟虫腈一种化合物进行检测，且分析时间较长[9]。国标方法只涉及鸡蛋基质中氟虫腈及其代谢物残留量的检测方法，此外其他行业标准采用固相萃取法进行检验，其操作过程复杂，耗时长，回收率不稳定。近年来QuEChERS方法在农药残留检测中应用较广，常用的净化材料主要有十八烷基键合硅胶（C18）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、多壁碳纳米管（MWCNTs）等[10]。石墨化多壁碳纳米管（Graphitized multi-wall carbon nanotubes，GMWCNTs）是一种新型纳米材料，由于具有纳米级别的中空管结构和较大的比表面积，表现出独特的吸附能力，经高温石墨化处理可以有效减小纳米管粉体内的非晶碳，进而消除管状结构内的缺陷[11-12]。目前，利用GMWCNTs作为净化材料在药食同源食品农药残留分析领域鲜有报道。因此，试验采用新兴净化材料GMWCNTs并结合超高效液相色谱质谱联用技术建立药食同源食品中苯基吡唑类农药的快速检测方法，为相关监管部门的日常抽检和风险监测提供技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Iclass/Xevo TQD高效液相色谱质谱联用仪（配有电喷雾离子源、三重四极杆线性离子阱质量分析器及MassLynx 4.1工作站，美国Waters公司）；SiO-6512 QuEChERS全自动样品制备系统（配有涡流振动离心机，12位均质离心转子，均质分离工作站，北京ABILITY公司）；EVA50A氮吹仪（北京普立泰科仪器有限公司，中国）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；Centrifuge 5810R高速离心机（德国Eppendorf公司）；VORTEX-5涡旋混匀器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；ME204/02电子天平（美国梅特勒公司）。

乙腈、丙酮、甲醇、甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；试验用水（美国Millipore公司）；提取剂包（4.0 g无水硫酸镁，1.0 g氯化钠，1.0 g柠檬酸钠，0.50 g柠檬酸二钠，均为分析纯）、N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化多壁碳纳米管（GMWCNTs）、聚丙烯整合管、ZrO2珠包（北京Ability公司）；石墨化氨基固相萃取柱（美国安捷伦公司）；农药标准品（纯度≥95%，德国Dr Ehrenstorfer公司）。

1.2 试验条件

1.2.1 标准溶液的配制

1.2.1.1 标准储备溶液

分别准确称取10 mg（精确至0.01 mg）丁虫腈、氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈亚砜标准品于10 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，于-18 ℃避光保存。用甲醇稀释标准储备液，配制成一定浓度的混合标准工作液，于4 ℃避光保存，备用。

1.2.1.2 空白基质溶液的制备

取空白样品，按1.2.3小节处理，过0.22 μm微孔滤膜后，于4 ℃保存备用。

1.2.2 试样制备

样品干燥后粉碎处理，过50目筛（筛孔0.300 mm），在常温下保存。

1.2.3 试验方法

准确称取2 g试样，精确至0.01 g，分别至整合管外管，依次加入5 mL超纯水、ZrO2珠包（24粒）、10.0 mL乙腈、6.5 g QuEChERS盐包。将装有净化剂的内管（净化剂为0.9 g MgSO4、0.2 g PSA、0.18 g GMWCNTs）放入整合管并拧紧，放入SiO-6512主机中。运行方法：第Ⅰ步，1 100 r/min震动5 min；第Ⅱ步，以4 000 r/min离心10 min；第Ⅲ步，以1 100 r/min振动5 min；第Ⅳ步，以4 000 r/min离心5 min。程序结束后取出整合管，准确吸取1.00 mL上清液过0.22 μm微孔滤膜，待LC-MS/MS测定。

1.2.4 仪器方法

1.2.4.1 液相色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm I.D.×100 mm）；柱温35 ℃；进样量1.0 μL；流速0.3 mL/min；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；梯度洗脱：0～0.5 min，5% A；0.5～8.5 min，5%～95% A；8.5～10.0 min，95% A；10.0～12.0 min，5% A。

1.2.4.2 质谱条件

电离方式：电喷雾离子源（ESI-）；扫描方式：多重反应监测（MRM）；去溶气温度500 ℃；去溶气流速900 L/Hr；毛细管电压3.00 kV；锥孔电压45 V；离子源温度150 ℃；碰撞气，高纯氩气（99.999%）。各农药质谱参数见表1。

表1 苯基吡唑类农药的保留时间及质谱参数

2 结果与讨论

2.1 净化剂种类及用量的优化

药食同源食品基质较为复杂，存在多糖、有机酸、脂肪酸、色素等干扰物，试验选择MgSO4、PSA、GMWCNTs作为净化材料，通过对比不同净化剂含量、组合对目标化合物回收率的影响，得出最佳的净化剂组合。

2.1.1 无水硫酸镁使用量的优化

MgSO4可以有效降低有机相中的水分，有利于GMWCNTs与样品杂质结合，提高净化效率。试验使用2.0 g肉桂空白样品，通过加标回收优化无水硫酸镁的使用量。净化剂由200 mg PSA、180 mg GMWCNTs及不同量的MgSO4（800，900，1 000和1 100 mg）组成。如图1所示，随着MgSO4用量的增加，各农药的回收率逐渐增高，当MgSO4用量达到900 mg时，除氟虫腈砜以外的化合物回收率均变化不大。为了达到较好的脱水效果且考虑试验成本，选择无水硫酸镁的用量900 mg。

图1 不同无水硫酸镁用量对肉桂中农药回收率的影响

2.1.2 PSA使用量的优化

将2.0 g肉桂空白样品按1.2.3小节处理，通过加标回收优化PSA使用量。净化剂由900 mg MgSO4、180 mg GMWCNTs及不同量的PSA（100，150，200和250 mg）组成，结果如图2所示。当PSA含量较低时，各化合物回收率较低；随着PSA含量的增加，化合物的回收率逐渐增加；当PSA含量为200 mg时，回收率趋于稳定。因此，试验选择200 mg PSA作为净化最佳用量。

图2 不同PSA用量对肉桂中农药回收率的影响

2.1.3 GMWCNTs使用量的优化

将2.0 g肉桂空白样品，按1.2.3小节处理，通过加标回收优化GMWCNTs使用量。净化剂由900 mg MgSO4、200 mg PSA及不同量的GMWCNTs（60，100，140，180和220 mg）组成，结果如图3所示。当GMWCNTs用量为60 mg时，丁虫腈、氟虫腈、氟虫腈砜回收率均小于80%；当用量为180 mg时，各化合物回收率均接近100%。因此，试验选择180 mg GMWCNTs作为净化最佳用量。

图3 不同GMWCNTs用量对肉桂中农药回收率的影响

2.2 与传统固相萃取方法的比较

为了验证改良QuEChERS方法的净化效果，将其与传统固相萃取方法（采用石墨化氨基固相萃取柱净化）进行比较。向肉桂空白样品中添加50.0 μg/kg浓度水平的混合标准溶液，对比两种方法的净化效果。图4（a）和（b）分别显示了未经净化处理的肉桂样品MRM色谱图与传统的固相萃取法处理的样品溶液色谱图。通过与改良QuEChERS方法净化后的肉桂样品色谱图（图4c）比较可以看到干扰峰的背景明显降低，说明该方法对于样品中含有的多糖、有机酸、醛类、酯类等极性和弱极性物质均能达到良好的净化效果。

图4 采用不同净化方式处理后的各农药总离子流色谱图

2.3 基质效应

在质谱法检测过程中，样品中的基质成分对目标化合物的离子化有一定的增强或抑制作用，进而影响测定结果的精密度和准确度。试验通过比较肉桂、金银花、山药、葛根空白基质与乙腈配制的混合标准溶液的斜率，评价基质效应。公式：ME=mmatrix/msolvent×100%，其中ME为基质效应，mmatrix、msolvent分别为基质标准曲线和溶剂标准曲线的斜率，比值越接近1，则基质效应越小。表2显示：不同化合物在不同基质中存在不同的基质效应，不同的样品基质中肉桂基质效应较大，5种化合物中氟虫腈基质效应最为显著。因此，试验采用相近空白基质配制标准曲线对样品进行校正。

2.4 方法的线性范围及检出限

试验利用优化的分析方法，分别用阴性样品空白基质配制不同浓度的混合标准溶液，经UPLC-MS/MS检测，以化合物质量浓度为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。向阴性样品中添加目标化合物，以样品峰响应值为3倍和10倍噪音的添加浓度作为方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果显示：苯基吡唑类化合物的色谱峰面积（y）与其质量浓度（x，ng/mL）在各自的线性范围内具有良好的线性关系，线性相关系数均大于0.99。方法的检出限在2.00～4.38 μg/kg之间，定量限在5.99～13.15 μg/kg之间，结果见表2。

表2 线性范围、线性方程、相关系数、基质效应及检出限、定量限

2.5 方法的回收率及精密度

选用阴性样品肉桂、金银花、山药、葛根，分别向其中添加20.0，40.0和80.0 μg/kg三个浓度水平的混合标准溶液，每个添加水平做5次平行，采用基质匹配标曲进行定量分析，考察方法的回收率和精密度。由表3可知，苯基吡唑类农药的加标回收率在68.8%～128.1%之间，相对标准偏差（δRSD）＜10.3%。

表3 不同基质中各农药的回收率及相对标准偏差（n=5）

2.6 实际样品检测

采用试验建立的分析方法对市售的金银花、枸杞、葛根、肉桂、山药、菊花6种药食同源食品的50批次样品进行了检测，其中1批次金银花中检出0.018 mg/kg氟虫腈，其余样品均未检出。

3 结论

采用石墨化多壁碳纳米管作为前处理净化剂，并结合UPLC-MS/MS建立了针对药食同源性食品中苯基吡唑类农药的改良QuEChERS检测方法。该方法与传统的固相萃取法相比，净化效果良好，有效降低了药食同源食品中色素、多糖等大分子物质的干扰，同时使用全自动QuEChERS样品制备系统，避免了前处理过程中人为操作带来的误差，进一步简化了试验过程。该方法操作简便有效、准确可靠，可用作药食同源食品中苯基吡唑类农药残留的参考检测方法。