miR-19b-3p靶向MTUS1调控甲状腺髓样癌细胞凋亡的分子机制

陈 国，韩鹏黎，陈柯茹，李明闯，张青松，陈 征，董汉华，钱跃军，吕 晶

1.郑州大学附属郑州中心医院甲状腺外科，河南 郑州 450007；2.郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心，河南 郑州 450007

甲状腺髓样癌（medullary thyroid cancer，MTC）是一种起源于甲状腺滤泡旁细胞的恶性肿瘤，发病率占全部甲状腺恶性肿瘤的3%～5%，病死率高达13.4%［1-2］，易出现淋巴结转移和远处器官转移，预后相对较差，因此MTC的早期诊断和早期治疗尤为重要，寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。

miR-19b在非小细胞肺癌组织中高表达，并可参与其发生、发展过程［3］。miR-19b在黑色素瘤细胞中表达升高，可能是黑色素瘤治疗的潜在靶点［4］。miR-19b-3p在结肠癌组织及细胞系中表达上调，并可促进结肠癌细胞增殖［5］。但miR-19b-3p在MTC组织及细胞中的表达情况及其对MTC细胞凋亡的影响尚未可知。微管相关肿瘤抑制基因1（microtubule-associated tumor suppressor gene 1，MTUS1）在肾癌、胆囊癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌和头颈部肿瘤中低表达，提示其可能有抑癌作用［6-8］。MTUS1在甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）组织中低表达，MTUS1基因的表达异常在PTC的发生、发展中可能起着重要作用［9］。Ou等［10］研究发现，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）PTENP1可以通过miR-19b/MTUS1抑制宫颈癌患者的肿瘤细胞增殖和侵袭。通过靶基因预测，miR-19b-3p的靶基因可能是MTUS1，但miR-19b-3p是否通过调控MTUS1的表达影响MTC细胞的凋亡目前仍不清楚。因此，本研究通过体外观察miR-19b-3p表达对MTC细胞凋亡的影响，分析其是否靶向调控MTUS1从而发挥作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系与主要试剂

MTC-TT细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，F12k培养基胰酶溶液购自美国HyClone公司，TRIzol试剂、反转录试剂盒均购自美国Invitrogen公司；SYBR Green聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒购自罗氏公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；MTUS1、Bcl-2、Bax、活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抗体均购自美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记的IgG二抗购自美国Santa Cruz公司；anti-miR-19b-3p、miR-19b-3p mimics、si-MTUS1及其各自阴性对照均购自上海吉玛制药技术有限公司；增强化学发光试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 研究对象

以2017年3月—2018年5月郑州大学附属郑州中心医院收治的36例MTC患者为研究对象，所有患者均经临床病理学检查证实为MTC，男性12例，女性24例，平均年龄（56.75±4.93）岁；所有患者均接受手术治疗并于术中切除MTC组织及癌旁组织，迅速将组织放入液氮中，术后将其转移至-80 ℃超低温冰箱。所有患者术前均未接受放疗或化疗，本研究经郑州大学附属郑州中心医院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染与分组

MTC-TT细胞复苏后用培养基（F12k培养基+20%胎牛血清+1%双抗）培养细胞，于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中常规培养。待细胞培养融合度达到80%时转染。将MTC-TT细胞分为anti-miR-19b-3p组、anti-miR-NC组、pcDNAMTUS1组、pcDNA组、anti-miR-19b-3p+si-MTUS1组、anti-miR-19b-3p+si-NC组、miR-19b-3p组、miR-NC组，转染后6 h换液，继续培养48 h。

1.2.2 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）检测MTC组织及MTC-TT细胞中miR-19b-3p、MTUS1 mRNA的表达

收集MTC组织及MTC-TT细胞各组对数生长期细胞，采用TRIzol一步法提取总RNA，反转录试剂盒合成cDNA，扩增条件为：95℃预变性1min，95℃15s，47℃20s，72℃45s，35个循环。熔解曲线：47℃→95℃，每20s升温1℃。目的基因扩增用ΔΔCt法计算，A=Ct（目的基因，实验样本）-Ct（内标基因，实验样本），B＝Ct（目的基因，对照样本）-Ct（内标基因，对照样本），K＝A-B，表达倍数＝2-K。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，详见表1。

表1 RTFQ-PCR引物序列Tab.1 RTFQ-PCR primer sequence

1.2.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测MTC组织及MTC-TT细胞中MTUS1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达

收集MTC组织及MTC-TT各组对数生长期细胞，细胞裂解提取蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度，以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离胶分离蛋白，转膜，将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h，加入已稀释好的一抗4 ℃下过夜，回收已稀释的一抗，用洗膜缓冲液（tris buffered saline Tween，TBST）洗3次，每次5 min，加入稀释好的二抗，室温温育30 min，用TBST在室温下的摇床上洗4次，每次5 min，化学发光检测，凝胶成像系统测定目的条带的吸光度（D）值。

1.2.4 双荧光素酶报告基因实验

利用TargetScans靶基因预测软件筛选出的MTUS1可能为miR-19b-3p的靶基因，MTUS1的3’非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）可能是miR-19b-3p的结合位点。将含有miR-19b-3p结合位点的MTUS1 3’-UTR序列及其突变体插入荧光素酶报告基因载体中得到WT-MTUS1、MUT-MTUS1，另将MTC-TT细胞接种于24孔板中，miR-19b-3p mimic组或miR-NC组分别与WT-MTUS1、MUT-MTUS1共转染人MTC-TT细胞，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱内继续培养24 h，收集细胞，裂解后置于室温下振荡20 min，采用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞的荧光素酶活性。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-19b-3p和MTUS1在MTC组织中的表达

RTFQ-PCR检测MTC组织及癌旁组织中miR-19b-3p和MTUS1 mRNA的表达，结果显示，MTC组织中miR-19b-3p的表达水平（2.741±0.049）较癌旁组织（0.894±0.037）显著升高（P＜0.05），而MTC组织中MTUS1 mRNA的表达水平（0.475±0.031）较癌旁组织（1.128±0.026）显著降低（P＜0.05），MTC组织中MTUS1蛋白的表达水平（0.329±0.020）较癌旁组织（0.872±0.0 3 3）也显著降低（P＜0.05，图1）。36例MTC患者MTC组织及癌旁组织中miR-19b-3p和MTUS1 mRNA的表达情况见表2。

图1 miR-19b-3p和MTUS1在MTC组织及癌旁组织中的表达Fig.1 Expression of miR-19b-3p and MTUS1 in MTC tissue and para-carcinoma tissue

表2 miR-19b-3p和MTUS1在MTC组织及癌旁组织中的表达情况Tab.2 Expressions of miR-19b-3p and MTUS1 in MTC and para-carcinoma tissue

2.2 抑制miR-19b-3p表达对MTC-TT细胞凋亡的影响

采用RTFQ-PCR实验验证转染anti-miR-19b-3p的转染效果，结果显示，anti-miR-19b-3p转染组中miR-19b-3p的表达水平（0.361±0.038）与anti-miR-NC转染组（1.028±0.084）相比显著降低（P＜0.05）。Western blot检测结果显示，anti-miR-19b-3p转染组中Bcl-2蛋白的表达水平（0.351±0.046）较anti-miR-NC转染组（0.758±0.083）显著降低（P＜0.05），而anti-miR-19b-3p转染组中Bax蛋白的表达水平（0.682±0.038）较anti-miR-NC转染组（0.319±0.074）显著升高（P＜0.05），antimiR-19b-3p转染组中cleaved caspase-3蛋白的表达水平（0.592±0.062）较anti-miR-NC转染组（0.257±0.057）也显著升高（P＜0.05，图2）。表明抑制miR-19b-3p表达可通过调控细胞凋亡相关蛋白表达进而诱导MTC-TT细胞凋亡。

图2 抑制miR-19b-3p表达对MTC-TT细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of inhibition of miR-19b-3p expression on apoptosis of MTC-TT cells

2.3 MTUS1过表达对MTC-TT细胞凋亡的影响

采用Western blot检测MTUS1过表达的转染效果，pcDNA-MTUS1组MTC-TT细胞中MTUS1的蛋白表达水平（0.869±0.041）较pcDNA组（0.547±0.027）显著升高（P＜0.05），提示转染成功。pcDNA-MTUS1组（0.604±0.033）较pcDNA组（0.298±0.052）明显促进Bax的表达（P＜0.05），pcDNA-MTUS1组（0.634±0.021）较pcDNA组（0.781±0.042）明显抑制Bcl-2的表达（P＜0.05，图3）。表明MTUS1过表达可通过调控细胞凋亡相关蛋白表达进而诱导MTC-TT细胞凋亡。

图3 MTUS1过表达对MTC-TT细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of MTUS1 overexpression on apoptosis of MTC-TT cells

2.4 miR-19b-3p靶向调控MTUS1的表达

采用TargetScan预测miR-19b-3p的靶基因，结果显示，MTUS1可能为miR-19b-3p的功能性靶基因，MTUS1的3’-UTR的靶点见图4A。共转染WT-MTUS1与miR-19b-3p mimic的荧光素酶活性（0.385±0.050）较共转染WT-MTUS1与miR-NC的荧光素酶活性（0.998±0.047）显著降低（P＜0.05），而共转染MUT-MTUS1与miR-19b-3p mimic的荧光素酶活性（0.998±0.041）较共转染WT-MTUS1与miR-NC的荧光素酶活性（0.999±0.033）差异无统计学意义（P＞0.05，图4），表明MTUS1是miR-19b-3p的直接靶基因。miR-19b-3p组MTC-TT细胞中MTUS1的表达水平（0.1937±0.0201）较miR-NC组（0.5269±0.0317）显著降低（P＜0.05），anti-miR-19b-3p组MTC-TT细胞中MTUS1的表达水平（0.8364±0.0403）较anti-miR-NC组（0.5071±0.0282）显著升高（P＜0.05）。这表明miR-19b-3p可负向调控靶基因MTUS1的表达。

图4 miR-19b-3p靶向调控MTUS1的表达Fig.4 miR-19b-3p targeted regulation of MTUS1 expression

2.5 抑制MTUS1表达逆转了抑制miR-19b-3p表达对MTC-TT细胞凋亡的作用

Anti-miR-19b-3p+si-MTUS1组MTC-TT细胞中Bcl-2蛋白的表达水平（0.706±0.036）较anti-miR-19b-3p+si-NC组（0.341±0.072）上调（P＜0.05），而Anti-miR-19b-3p+si-MTUS1组MTC-TT细胞中Bax蛋白的表达水平（0.428±0.072）较anti-miR-19b-3p+si-NC组（0.725±0.037）下调（P＜0.05，图5），表明抑制MTUS1表达可恢复抑制miR-19b-3p表达对MTC-TT细胞凋亡的作用。

图5 抑制MTUS1表达逆转了抑制miR-19b-3p表达对MTC-TT细胞凋亡的作用Fig.5 Inhibition of MTUS1 expression reverses effect of inhibition of miR-19b-3p expression on apoptosis of MTC-TT cells

3 讨论

miR-19b-3p在前列腺癌、胃癌等恶性肿瘤中均高表达，其可能作为肿瘤早期诊断及评估患者预后的潜在生物标志物［11-12］。Wei等［13］研究表明，苦参碱可通过调控miR-19b-3p/PTEN轴进而抑制黑色素瘤的发生、发展进程。Jin等［14］研究表明，下调miR-19b-3p可通过调节PI3K/Akt通路抑制乳腺癌细胞增殖并逆转塞卡替尼的抗性。刘磊峰等［15］研究表明，沉默miR-19b-3p表达可上调亮氨酸重复和免疫球蛋白样结构域1（leucinerich repeats and immunoglobulin-like domains 1，LRIG1）的表达从而诱导喉癌细胞凋亡并增强其放射敏感性。Wei等［16］研究发现，在胃癌发生过程中存在miR-19b-3p/Nrp1调控网络，miR-19b-3p/Nrp1轴可能成为胃癌诊断和治疗的潜在靶点。

本研究检测MTC组织、癌旁组织及MTC-TT细胞中miR-19b-3p的表达水平，结果发现，miR-19b-3p的表达水平均显著升高，体外培养MTCTT细胞并转染anti-miR-19b-3p从而抑制其表达，进一步观察细胞凋亡情况，结果显示，抑制miR-19b-3p表达可明显促进MTC细胞凋亡，并可促进Bax、cleaved caspase-3表达及抑制Bcl-2表达。已有研究［17］指出，Bcl-2属于抗凋亡基因，Bax属于凋亡基因，Bcl-2可通过调控线粒体凋亡通路激活caspase-3级联反应进而促进细胞凋亡。提示下调miR-19b-3p表达可通过调控细胞凋亡相关蛋白进而促进MTC细胞凋亡。

综上所述，MTC中miR-19b-3p、MTUS1的表达异常与细胞凋亡相关，靶向下调miR-19b-3p的表达可上调靶基因MTUS1的表达，通过调控细胞凋亡相关蛋白进而促进MTC细胞凋亡，其可能作为MTC的潜在治疗靶点及MTC的早期诊断分子标志物，但其是否可在临床上广泛应用仍需临床实践证实。