缺氧诱导食管鳞癌细胞中白细胞介素-7表达促进肿瘤进展

陈 杰，王 嫣，张维敏，赵 笛，张凌瑗，詹启敏

北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所分子肿瘤学研究室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142

食管癌是常见的消化道肿瘤，中国是食管癌高发国家之一，世界上超过50%的食管癌发生在中国［1-3］。现阶段中国食管癌患者5年生存率为30.3%。食管癌有两种主要的病理学类型，分别为食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophageal adenocarcinoma，EAC）。在中国，食管癌的类型主要为ESCC，占95%以上。临床上治疗ESCC的一线化疗药物主要为顺铂，但是其效果不佳，极易出现耐药。此外，ESCC分子分型不明确，导致很多基于分子靶点开展的靶向治疗的效果仍存在争议。因此，阐明诱导ESCC进展的分子机制将为治疗ESCC提供有效的分子靶点。

缺氧是介导实体瘤进展的重要因素［4］。临床研究［5］显示，缺氧与肿瘤患者不良预后密切相关。在基础医学研究中，缺氧能够诱导肿瘤细胞代谢改变、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及肿瘤干细胞形成，使肿瘤细胞增殖、侵袭、转移能力增强，并产生放化疗抵抗［6-8］。研究［9］发现，缺氧能够诱导肿瘤细胞自分泌细胞因子，进而促进肿瘤进展。本研究将筛选缺氧诱导ESCC细胞中细胞因子表达谱，并重点研究白细胞介素（interleukin，IL）-7对缺氧情况下ESCC进展的影响。

1 材料和方法

1.1 试剂与耗材

IL-7中和抗体（货号：MAB207）及IL-7酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号：HS750）均购自美国R&D公司，细胞因子阵列蛋白芯片（货号：AAH-CYT-6）及蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）定量ELISA活性检测试剂盒（货号：PELAKT-S473-T-1）购自美国RayBiotech公司，MTS检测试剂盒（货号：G3580）购自美国Progema公司，RPMI-1640培养基（货号：A1049101）及胎牛血清（货号：10099）均购自美国Gibco公司，transwell侵袭小室（货号：CLS3422）购自美国Corning公司。

1.2 细胞培养

人ESCC细胞系KYSE410和KYSE30均由恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室保存。细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养。常氧培养条件为：37 ℃、CO2体积分数为5%。缺氧培养条件为：37 ℃、N2体积分数为94%、CO2体积分数为5%、O2体积分数为1%。

1.3 细胞因子阵列蛋白芯片检测细胞因子分泌

将KYSE410细胞分别置于常氧及缺氧条件下培养。24 h后，收集上清液，将1 mL细胞上清液与包被细胞因子抗体的蛋白芯片于4 ℃过夜温育。之后弃上清液，加入洗液清洗蛋白芯片后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（horseradish peroxidase-streptavidin，HRP-SA）室温温育2 h后，洗去HRP-SA，加入显色液曝光显影。

1.4 MTS法检测细胞增殖能力

取对数生长期细胞，以每孔3 000个细胞的密度均匀接种于96孔板中，待细胞贴壁后，置于缺氧培养环境并加入磷酸盐缓冲液（phosphatebuffered saline，PBS）及IL-7中和抗体。48 h后，每孔加入10 μL MTS溶液。使用酶标仪测定490 nm波长处每孔的吸光度（D）值。实验重复5次取平均值。

1.5 侵袭迁移实验

将KYSE410及KYSE30在不含血清的RPMI-1640培养基中于常氧培养条件下培养。12 h后，收集细胞，以每孔10 000/200 μL的密度接种于覆盖（侵袭实验）或不覆盖基质胶（迁移实验）的transwell小室的上室，下室中加入1 mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，缺氧培养条件下培养24 h后取出小室，甲醇固定5 min，结晶紫染色30 min后，擦去上室内的细胞。显微镜下拍照并计数。实验重复5次取平均值。

1.6 ELISA法检测IL-7分泌及AKT活性

在检测IL-7分泌的过程中，将KYSE410及KYSE30细胞分别置于常氧及缺氧培养条件下。24 h后，收集上清液，将20 μL样本与80 μL样本稀释液混匀后，加入96孔板中，室温温育2 h后，洗掉样本。逐步加入一抗稀释液、洗脱、加入HRP-SA、洗脱、加入显色液、置于室温避光温育30 min后，加入终止液，混匀后酶标仪检测D值。实验重复3次取平均值。

在检测AKT活性的过程中，将KYSE410及KYSE30细胞分别置于常氧及缺氧培养条件下。24 h后，收集细胞，用裂解液裂解蛋白，将蛋白裂解液（约20 μg/孔）加入96孔板后，按照试剂盒使用说明检测肿瘤细胞AKT活性（磷酸化AKT Ser473的D值/总AKT的D值）。实验重复5次取平均值。

1.7 统计学处理

采用GraphPad Prism 7.0版统计软件进行数据分析。实验数据均以的形式表示。独立两组间比较使用非配对t检验。量效关系使用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺氧诱导ESCC细胞中细胞因子及趋化因子表达谱改变

缺氧微环境可以诱导肿瘤细胞中细胞因子分泌增强，但是缺氧对ESCC细胞中细胞因子表达的调控仍未可知。为明确缺氧调控ESCC细胞中哪些细胞因子，本研究采用细胞因子阵列蛋白芯片技术分析常氧状态下ESCC细胞系KYSE410与缺氧状态下KYSE410中的细胞因子表达谱，发现缺氧处理24 h后，KYSE410细胞分泌多种细胞因子，如IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、单核细胞趋化蛋白2（monocyte chemoattractant protein 2，MCP2）、C-C趋化因子配体（C-C motif chemokine ligand，CCL）5、CCL17、CCL18及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。这些细胞因子均与肿瘤进展关系密切，参与肿瘤细胞增殖、侵袭转移、血管新生及免疫细胞对肿瘤细胞的作用。其中，ESCC细胞在缺氧状态下IL-7的分泌增高最为明显（图1）。

图1 缺氧诱导KYSE410细胞中细胞因子表达谱改变Fig.1 Hypoxia induced the expression profile of cytokines and chemokines of KYSE410 cell

2.2 缺氧诱导ESCC细胞中IL-7分泌增强

进一步研究缺氧是否可以介导ESCC细胞中IL-7分泌增多，以常氧条件培养的KYSE410、KYSE30细胞系为常氧组，缺氧24 h培养的KYSE410、KYSE30细胞系为缺氧组，并通过ELISA法分析两个细胞系中IL-7的分泌情况。ELISA法实验结果显示，缺氧显著诱导ESCC细胞系中IL-7的分泌。对照组KYSE410细胞IL-7分泌量为（275.70±82.98）pg/mL，实验组KYSE410细胞IL-7分泌量为（2 451.00±87.90）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.001）；对照组KYSE30细胞IL-7分泌量为（325.80±85.46）pg/mL，实验组KYSE410细胞IL-7分泌量为（2 653.00±126.70）pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.001，图2）。

图2 缺氧诱导KYSE410及KYSE30细胞中IL-7分泌增强Fig.2 Hypoxia induced the IL-7 secretion from KYSE410 and KYSE30 cells

2.3 IL-7中和抗体抑制缺氧状态下ESCC细胞的增殖

在缺氧状态下（48 h），以PBS为对照，采用不同浓度的IL-7中和抗体（5、10 μg/mL）处理KYSE410及KYSE30细胞。MTS实验结果显示，IL-7中和抗体能够剂量依赖性地抑制ESCC细胞系增殖。对照组KYSE410细胞相对增殖率（与本组比较）为1.000±0.055，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.610±0.026，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.326±0.022，差异有统计学意义（P＜0.001）。对照组KYSE30细胞相对增殖率（与本组比较）为1.000±0.036，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.673±0.019，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对增殖率（与对照组比较）为0.359±0.017，差异有统计学意义（P＜0.001，图3）。

图3 IL-7中和抗体抑制缺氧状态下KYSE410及KYSE30细胞的增殖Fig.3 IL-7 neutralizing antibody inhibited proliferation of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

2.4 IL-7中和抗体抑制缺氧状态下ESCC细胞的侵袭及迁移

Transwell实验结果显示，相比对照组，随着IL-7中和抗体（5、10 μg/mL）浓度的增高，缺氧状态下，ESCC细胞系KYSE410及KYSE30侵袭及迁移能力显著降低。侵袭实验结果显示，对照组KYSE410细胞相对侵袭率（与本组比较）为1.000±0.117，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.388±0.070，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.174±0.025，差异有统计学意义（P＜0.001）。对照组KYSE30细胞相对侵袭率（与本组比较）为1.000±0.090，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.433±0.040，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对侵袭率（与对照组比较）为0.210±0.037，差异有统计学意义（P＜0.001，图4A）。迁移实验结果显示，对照组KYSE410细胞相对迁移率（与本组比较）为1.000±0.162，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.450±0.080，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.163±0.028，差异有统计学意义（P＜0.001）。对照组KYSE30细胞相对迁移率（与本组比较）为1.000±0.100，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.272±0.063，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组相对迁移率（与对照组比较）为0.160±0.049，差异有统计学意义（P＜0.001，图4B）。

图4 IL-7中和抗体抑制缺氧状态下KYSE410及KYSE30细胞的侵袭转移Fig.4 IL-7 antibody inhibited invasion or migration of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

2.5 IL-7中和抗体抑制缺氧状态下ESCC细胞中信号分子AKT的活性

本研究通过ELISA法分析缺氧对ESCC细胞系中AKT活性的影响，结果显示，缺氧24 h后，ESCC细胞系KYSE410及KYSE30中AKT Ser473活性显著上调（图5A）。对照组KYSE410细胞AKT活性为0.454±0.019，实验组KYSE410细胞AKT活性为0.744±0.047，差异有统计学意义（P＜0.001），对照组KYSE30细胞AKT活性为0.462±0.037，实验组KYSE30细胞AKT活性为0.809±0.064，差异有统计学意义（P＜0.001，图5A）。外加IL-7中和抗体能够有效地抑制KYSE410及KYSE30细胞中AKT Ser473的磷酸化激活（图5B）。对照组KYSE410细胞AKT活性为0.756±0.058，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE410细胞组AKT活性为0.441±0.038，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE410细胞组AKT活性为0.214±0.028，差异有统计学意义（P＜0.001）。对照组KYSE30细胞AKT活性为0.815±0.082，IL-7中和抗体（5 μg/mL）处理KYSE30细胞组AKT活性为0.472±0.04，差异有统计学意义（P＜0.001）。IL-7中和抗体（10 μg/mL）处理KYSE30细胞组AKT活性为0.234±0.029，差异有统计学意义（P＜0.001，图5B）。

图5 IL-7中和抗体抑制缺氧状态下KYSE410及KYSE30细胞中AKT活性Fig.5 IL-7 antibody inhibited the AKT activity of KYSE410 and KYSE30 cells under hypoxia

A:Quantitative ELISA assay was used to evaluate theDvalue of pAKT Ser473/theDvalue of total AKT (AKT activity) in KYSE410 and KYSE30 cells under normoxic or hypoxic condition for 24 h.B:Quantitative ELISA assay was applied to examine the AKT activity in KYSE410 and KYSE30 cells treated with PBS (control solvent),or IL-7 antibody (5,10 μg/mL),under hypoxia for 24 h.**:P＜0.001,compared with normoxia;***:P＜0.001,compared with control group

3 讨论

本研究显示，缺氧可诱导ESCC细胞中多种细胞因子及趋化因子的自分泌表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、MCP2及CCL5等。其中，TNF-α、IL-1β及IL-10是慢性炎症与肿瘤关联的重要细胞因子，这些因子的多态性与肿瘤进展关系密切［10］。IL-6能够通过调控肿瘤细胞可塑性、介导化疗耐药，进而促进肿瘤进展。肿瘤微环境释放的CCL5，能够通过作用于肿瘤细胞中相应受体CCR5，介导肿瘤的多种恶性表型［11］。因此，细胞因子的活性增强是调控肿瘤进展的重要因素之一。

本研究重点阐明了IL-7作为缺氧诱导细胞因子，介导ESCC进展及相关分子机制。IL-7能够产生广泛免疫效应，在免疫细胞活化过程、产生免疫应答效应、调控自身免疫性疾病及抗纤维化中具有重要作用，是细胞因子研究领域的热点因子。在肿瘤学领域，IL-7与肿瘤关系复杂。其中，IL-7参与多种免疫细胞对肿瘤生长增殖的调控。在嵌合抗原受体T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）细胞免疫疗法中，CAR-T细胞中高表达的IL-7能够增加免疫细胞在局部实体瘤的浸润并增强CAR-T细胞的抗癌效应［12］。但是，IL-7的受体IL-7R是一个重要的癌基因，IL-7/IL-7R轴能够通过调控肿瘤细胞中细胞周期蛋白D1的表达，进而促进肿瘤细胞增殖并抵抗凋亡［13］。在细胞实验中，加入IL-7重组蛋白能够通过激活前列腺癌细胞中AKT/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号转导通路，进而增强基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-3及MMP-9分泌，促进前列腺癌细胞侵袭能力的增强［14］。本研究显示，缺氧ESCC细胞中自分泌产生的IL-7能够介导肿瘤细胞增殖、侵袭及转移，拮抗IL-7的功能显示，抑制缺氧状态下ESCC细胞的增殖、侵袭及转移，证实IL-7是介导肿瘤细胞在缺氧微环境中进展的重要细胞因子。

研究［15］显示，细胞因子介导肿瘤进展主要与激活肿瘤细胞中的信号通路有关。IL-6可以通过激活JAK家族激酶/信号转导与激活转录因子通路促进多种肿瘤进展，且此信号轴是肿瘤治疗中重要的靶点信号轴。多种细胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-8、MIP2及CCL2等，均与肿瘤细胞中NF-κB信号通路的激活及多种恶性细胞表型的形成密切相关［16］。有研究［17-18］显示，IL-7能够通过激活信号通路促进肿瘤进展，如磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/AKT通路及JAK1/Stat5信号转导通路。AKT是介导ESCC进展最重要的信号分子，本研究结果显示，拮抗IL-7的功能能够显著抑制缺氧条件下ESCC细胞中AKT的活性，但IL-7能否也通过调控其他信号分子，进而诱导ESCC进展仍有待于进一步研究。

本研究通过蛋白芯片技术研究缺氧介导ESCC细胞中细胞因子的表达情况，并研究了IL-7对缺氧促进ESCC进展的影响及相关分子机制，为深入研究缺氧-细胞因子轴介导肿瘤进展提供了新思路。