KLK8通过调节EGF对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制

花 晴，申雪芳，许平波

复旦大学附属肿瘤医院麻醉科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一。近年来，由于化疗、免疫治疗和靶向治疗的飞速发展，结直肠癌患者的总生存率显著提升。但由于其高发病率，结直肠癌仍是死亡率较高的恶性肿瘤之一［1-2］。人组织激肽释放酶相关肽酶家族（kallikrein-related peptidases，KLKs）由KLK1～KLK15组成，是一组具有胰蛋白酶和糜蛋白酶样活性的丝氨酸蛋白酶［3-4］。KLKs具有多种生物学功能，在血液凝固、补体激活、胚胎发育和伤口愈合等方面具有重要作用［5-7］。作为KLKs家族的重要成员，KLK8是一种突触相关的丝氨酸蛋白酶，可参与多种生物活动如表皮增殖分化、角质形成等［8］。近年来，越来越多的研究［6，9］表明，KLK8与肿瘤的发生、发展密切相关，其在卵巢癌［10］、宫颈癌［11］和肺癌［12］等多种肿瘤中均异常表达。与此同时，越来越多的证据［13-14］证明，KLK8可作为肿瘤生存和预后的生物学标志物。然而，KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响尚未可知。为进一步探索KLK8促进结直肠癌细胞凋亡的机制，本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库，通过基因集富集分析法（gene set enrichment analysis，GSEA），对KLK8高表达和低表达的结直肠癌组织进行基因表达分析。结果发现，KLK8高表达与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的分解、表皮发育密切相关。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）由53个氨基酸残基组成，编码基因位于人类染色体4（4q25-27）上，可在多种正常细胞、人类癌组织中表达。有研究［15-17］表明，EGF可以抑制肿瘤细胞的凋亡。作为一种丝氨酸蛋白酶，KLKs具有水解多种蛋白底物的能力，有研究［18］表明，KLK8可通过剪切激活EGF，促进心肌肥厚。那么，KLK8是否可通过EGF途径对结直肠癌细胞的凋亡产生影响？本研究将探讨KLK8对结直肠癌细胞凋亡的调节作用及其机制，为进一步探索KLK8对结直肠癌的影响及其潜在机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 细胞培养与实验试剂

人胚肾上皮细胞HEK-293T、人结直肠癌细胞RKO和SW480均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，所有细胞均培养在DMEM培养基（美国Invitrogen公司）中，所有培养基均添加10%胎牛血清（美国Gibco公司）和1%青霉素/链霉素（美国Invitrogen公司）。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）siRNA套装购自百奥生物技术（南通）有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，KLK8质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，嘌呤霉素购自美国Roche公司，ELISA试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司，兔抗人KLK8多克隆抗体（货号：ab150395）购自英国Abcam公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体（货号：sc-47778）购自美国Santa Cruz公司，山羊抗兔IgG二抗（货号：7076Ⅴ）和山羊抗小鼠IgG二抗（货号：7074Ⅴ）均购自美国Cell Signaling公司。

1.2 肿瘤基因组图谱分析与GSEA

GEO芯片数据集GSE21815、GSE37182和GSE71187从GEO官网（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载，用于比较结直肠正常组织和癌旁组织间的差异。TCGA结肠癌（COAD）由275例结直肠癌和349名健康志愿者组成，从USUC Xena网站（https://xenabrowser.net/datapages/?dataset=TCGA）下载。为阐明KLK8在结直肠癌中的作用机制，在Broad Institute平台上进行GSEA，并将统计学显著性设为0.25。利用“GO”基因集的方法，对KLK8高表达和低表达的结直肠癌数据进行基因表达差异分析，寻找KLK8的相关信号通路。

1.3 方法

1.3.1 质粒慢病毒包装

将HEK-293T以1×107个/10 cm培养皿的密度铺板。次日进行质粒转染。按照目的质粒（pcDNA3.1-KLK8质粒，上海吉凯基因化学技术有限公司）∶包装质粒psPAX2∶包装质粒pMd.2.G为2.0∶1.5∶0.5的比例，将3种质粒混合在500 μL无血清的Opti-MEM培养基中。按照LipofectamineTM3000产品说明书进行质粒转染。48 h后收集上清液。收集的病毒液经过滤器过滤后于-80 ℃储存。将RKO和SW480细胞以1×105细胞/孔的密度放置在6孔板中，培养过夜。细胞贴壁后，在细胞培养基中加入上述得到的病毒液。感染24 h后去除病毒液，加入新鲜细胞培养基。将2 μg/mL嘌呤霉素加入细胞培养基中，4周后产生稳定的KLK8过表达细胞系。收集耐药细胞进行后续分析。

1.3.2 siRNA转染细胞

配制转染反应体系：siRNA与转染试剂的比例为1 μg∶1 μL，分别用125 μL Opti-MEM温育于Ependorf试管中，室温温育5 min，然后混合。将RKO和SW480细胞以1×105个细胞/孔的密度铺板在6孔板中，培养过夜。待细胞贴壁后，加入上述转染体系，感染24 h后换液，加入新鲜细胞培养基。收集细胞进行后续分析。

1.3.3 蛋白质印迹法（Western blot）检测

按照十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝胶的配方制备合适浓度的SDS-PAGE凝胶胶板。将制备好的SDSPAGE胶板安装好。加入电泳缓冲液后，加入50 μg蛋白样品到凝胶内的上样孔中，80 Ⅴ电压电泳，电泳完毕后开始转膜，用甲醇激活聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PⅤDF）膜，100 Ⅴ转膜90 min。转膜完成后，采用5%胎牛血清室温封闭1 h。加入一抗KLK8（1∶1 000稀释）、β-actin（1∶5 000稀释），4 ℃摇床上温育过夜。第2天用1×磷酸盐吐温缓冲液（phosphate buffered saline with Tween，PBST）洗膜5次，每次7 min，加入对应一抗种属来源的HRP标记的二抗（山羊抗兔IgG二抗和山羊抗小鼠IgG二抗均为1∶5 000稀释），在室温摇床上温育1 h，用1×PBST洗膜5次，每次7 min。然后曝光成像。

1.3.4 Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡

计数铺RKO和SW480细胞，按照AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（货号：E606336）说明书处理细胞，处理好的细胞采用流式细胞术检测细胞凋亡。

1.3.5 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法检测EGF表达

收集RKO和SW480的细胞培养上清液，2 000～3 000 r/min离心20 min。仔细收集上清液。应用ELISA法检测细胞上清液中EGF的表达水平，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。每孔各加入标准品或待测样品100 μL，将反应板充分混匀后置于37 ℃ 40 min。接着用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。向每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μL（空白除外）。将反应板充分混匀后置于37 ℃ 20 min。然后用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔加酶标抗体工作液100 μL。将反应板置于37℃10 min。接着用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗处反应15 min。每孔加入100 μL终止液混匀。30 min内用酶标仪（型号：DENLEY DRAGON Wellscan MK 3）在450 nm处测吸光度（D）值。

1.4 统计学处理

实验中所有统计分析均使用SPSS 13.0软件进行。实验中所有的数据均以表示，两个样本间比较均使用t检验，多样本间用单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌中KLK8的表达情况

KLK8的表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关［10，12］。本研究采用GEO芯片数据集GSE21815、GSE37182和GSE71187分析发现，与正常组织相比，结直肠癌组织中KLK8的表达显著上调（图1）。

图1 KLK8在结直肠癌中表达升高Fig.1 KLK8 is highly expressed in colorectal cancer

2.2 KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响

细胞凋亡异常是人类恶性肿瘤的特征［19］。本研究通过构建KLK8过表达的RKO和SW480细胞系稳定转染细胞株和敲低细胞株来判断KLK8表达升高或降低是否会影响结直肠癌细胞的凋亡，Western blot检测证实已成功构建了KLK8过表达的RKO和SW480细胞系稳定转染细胞株和敲低细胞株（图2A）。采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术来检测KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响，与对照组相比，KLK8过表达显著抑制结直肠癌细胞的凋亡（图2B、C）。

图2 KLK8过表达抑制结直肠癌细胞的凋亡Fig.2 KLK8 overexpression inhibited apoptosis of colorectal cancer cells

2.3 GESA分析KLK8表达抑制结直肠癌细胞凋亡的机制

为深入了解KLK8抑制结直肠癌细胞凋亡的机制，本研究利用TCGA数据库，采用GSEA对KLK8高表达和KLK8低表达结直肠癌组织中的基因表达进行了分析。结果显示，根据KLK8表达水平的不同，142条富集途径的表达存在差异，本研究选取差异最明显的前20条通路（图3A，P＜0.05）。KLK8与ECM的分解、表皮发育通路正相关，这两种通路与细胞凋亡密切相关（图3B）。

图3 结直肠癌中KLK8高低表达显著富集的通路Fig.3 Significantly-altered pathways were predicted in colorectal cancer depending on KLK8 expression

2.4 KLK8抑制结直肠癌细胞凋亡的机制

作为一种丝氨酸蛋白酶，KLK8能切割并激活多种膜蛋白的细胞外部分，如EGF。EGF与表皮发育、ECM的降解密切相关［16-17］。在过表达KLK8的RKO和SW480细胞上清液中，EGF的表达明显升高（图4A），表明KLK8可以剪切EGF。接下来，本研究探讨了EGF的表达升高是否有助于KLK8在结直肠细胞中的抗凋亡功能。在过表达KLK8的RKO和SW480细胞中利用siRNA敲低EGFR（图4B），细胞凋亡明显增多（图4C、D），表明抑制EGFR可以逆转KLK8的抗凋亡作用。

图4 KLK8通过激活EGF抑制结直肠癌细胞的凋亡Fig.4 KLK8 inhibited colorectal cancer cell apoptosis via the activation of the EGF

3 讨论

结直肠癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下。发病率居恶性肿瘤第3位，死亡率居第2位［20-21］。因此，迫切需要研究结直肠癌的发病机制和分子生物学标志物，以促进结直肠癌的早期诊断、预后预测和制定有效的治疗策略。

KLK8参与肿瘤发展的多个阶段，如肿瘤的增殖、迁移和血管生成，与肿瘤的恶性行为密切相关［4，9，12］。有研究［22］表明，KLK8可促进结直肠癌细胞的增殖和转移，但KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制尚未可知。本研究通过GEO数据库分析发现，KLK8在结直肠肿瘤中表达升高。在结直肠癌细胞中过表达KLK8可抑制结直肠癌细胞的凋亡，而敲低KLK8可促进结直肠癌的凋亡。

KLKs具有水解多种底物的能力，如促表皮生长因子（pro-epidermal growth factor，pro-EGF）、蛋白酶激活受体（protease-activated receptor，PAR）和神经调节蛋白-1等［18］。本研究通过GSEA分析发现，KLK8高表达与表皮发育及ECM的分解密切相关。作为表皮发育的重要调节因子，EGF是一种含有53个氨基酸残基的多肽，可与EGFR结合，启动细胞内信号通路的级联反应。因此，EGF可参与多种生理学和病理学过程，包括细胞增殖、凋亡、迁移、存活和血管生成等［16-17］。本研究显示，过表达KLK8的结直肠癌细胞上清液中，EGF的表达量增多，表明KLK8可剪切结直肠癌细胞表面的pro-EGF，释放EGF。为进一步研究其对结直肠癌细胞凋亡的影响，本研究利用siRNA敲低EGF的细胞表面受体EGFR，采用AnnexinⅤ-FITC/PI双染法流式细胞术检测结直肠癌细胞的凋亡情况。结果发现，敲低EGFR后，结直肠癌细胞的凋亡增加，表明抑制EGFR可逆转KLK8抑制的结直肠细胞的凋亡，因此推测KLK8可通过剪切释放EGF，抑制结直肠癌细胞的凋亡。

本研究显示，KLK8在结直肠癌中表达升高。过表达KLK8可抑制结直肠癌细胞的凋亡，敲低KLK8可促进细胞的凋亡。KLK8可剪切释放EGF，敲低EGFR表达，阻断EGF调控信号通路可逆转KLK8对结直肠癌细胞凋亡的抑制作用。本研究阐明了KLK8对结直肠癌细胞凋亡的影响及其潜在机制，为结直肠癌的分子靶向治疗提供了新线索。