虫草素衍生物修饰纳米金的合成

王 雪,解利东,陈 岚,闫晶媛,崔琳琳

(1.哈尔滨商业大学 英才学院，哈尔滨 150028；2.哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨150076)

虫草素(3′-脱氧腺苷，3′-deoxyadenosine)是从人工培养的蛹虫草中提取出来的核苷类似物，也是从真菌中提取分离出来的第一种核苷类抗生素.虫草素具有多种活性和药理作用，如抗肿瘤、抗病毒、抗菌等[1-5].然而，自从20世纪50年代被发现以来，关于其体内实验的报道很少.其原因是在体内快速脱氨通过腺苷脱氨酶(ADA)的作用，会转变为生物活性最小的3′-脱氧次黄嘌呤核苷，半衰期较短，作用效果不持久，进而影响疗效[6-12].因此，为了改变虫草素脂溶性进一步增加其体内活性，本实验以虫草素为原料，在5′位置上接入新的基团，合成系列类似物(化合物B)，通过1H-NMR、13C-NMR测定化合物B结构，再对化合物B进行修饰纳米金通过化合物B制备法以及络合物C制备法得到络合物C，通过UV、MS对其进行结构表征进一步确定虫草素衍生物中存在纳米金颗粒，就有可能使脂溶性改变从而增强虫草素在体内的生物活性.虫草素衍生物的合成为后续活性分析提供思路，更好的研究新合成化合物的抗菌和抗癌的活性.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验仪器

UV-5200PC紫外可见分光光度计(上海元析)；P-040ST超声波清洗机(洁盟清洗)；DF-101S恒温加热磁力搅拌器(巩义予华)；KH-35A电热恒温干燥箱(康恒仪器)；AVANCEIIIHD500MHz核磁共振波谱仪(Bruker)；高分辨色谱仪(美国AB)；FTIR-1500傅里叶红外光谱仪(上海精密)；RE-5299旋转蒸发仪(巩义予华)；SHZ-95B循环水式多用真空泵(巩义予华)；GF254硅胶板(青岛海洋)YRT-3熔点仪(天大天发).

1.1.2 试药

虫草素原料药(质量分数>99%)(批号：20160910)(湖北邦盛)；二氯甲烷(分析纯)(批号：20140301)(天津天力)；甲醇(分析纯)(批号：20140301)(天津天力)；吡啶(分析纯)(批号：20140527)(天津富宇)；2-噻吩甲酰氯(2-Thiophenecarbonyl chloride)；(批号：20160613)(上海阿拉丁)；氘代试剂-DMSO(批号：20120610)(北京金鸥翔)；乙酸乙酯(分析纯)(批号：20150521)(天津富宇)；氯金酸(批号：20120611)(天津迈斯科)；柠檬酸钠(批号：20120521)(天津天力).

1.2 实验方法

1.2.1 虫草素衍生物的合成

以虫草素A为原料药，与2-噻吩酰氯反应.取虫草素1 g(0.004 mol)溶于40 mL无水吡啶中.恒温水浴70～85 ℃，氮气保护，在磁力搅拌下缓慢滴入0.004 mol 2-噻吩甲酰氯溶液.TLC监测反应(甲醇∶二氯甲烷=1∶10)，原料点消失，反应结束.反应时间为5 h.通过利用旋转蒸发仪来进行真空蒸馏，以除去吡啶溶液.得膏状混合物，60 ℃蒸馏水溶解膏状产物，目的是除去未反应的酰氯，分别用30 mL乙酸乙酯和水液来进行混合，萃取3次，然后合并有机相，将上述所合并的有机相运用旋转蒸发仪减压蒸馏得到固体粉末样样品，运用干法上样的方法，使用少量硅胶粉末拌匀样品，柱层析(甲醇∶二氯甲烷=1∶15)，上硅胶柱(2×75 cm玻璃柱，200～300目柱层析硅胶).经上述所得到化合物B反应路线如图1所示.

图1 化合物B反应路线

1.2.2 络合物制备方法

化合物B制备方法[13]：双蒸水40 mL中，加入质量分数为1%的氯金酸溶液0.6 mL，碳酸钠0.4 mL.在磁力搅拌条件下，加入新配制的质量浓度为0.5 mg/mL的虫草素溶液0.4 mL，磁力搅拌，直至出现橙红色，4 ℃静置密封保存.

络合物C制备方法[14]：向新制得的10 mL纳米金溶液中加入 100 μL的浓度为 10-2mol/L的虫草素衍生物溶液，在室温条件下修饰 2 h.

1.3 化合物的表征

1.3.1 熔点测定

采用电热熔点仪测定虫草素衍生物的熔点.虫草素衍生物的熔点测定值不进行校正.

1.3.2 UV分析方法

以甲醇为空白对照，超声助溶，对虫草素衍生物和虫草素标准品进行紫外扫描，比较虫草素衍生物和虫草素吸收波长的变化情况.

1.3.3 FTIR分析方法

通过利用傅里叶红外分光光度仪，采用干燥的KBr压片，测定虫草素及其衍生物红外光谱，目的为了观察新的化合物的红外色谱峰的变化情况.

1.3.4 NMR分析方法

以DMSO-d6为测定溶剂，以TMS为测定内标，用核磁共振仪测定虫草素衍生物的1H-NMR谱和13C-NMR谱.

1.3.5 MS分析方法

通过利用色谱级乙腈超声将化合物B进行溶解，进而制备成质量浓度为100 μg/mL的溶液，再进行质谱测定，确定分子质量.

1.3.6 XRD分析方法

通过在温度为100 ℃下将纳米金络合物C溶液烘干而制得粉末，然后平铺在载玻片上，再进行X射线衍射分析测试.

2 结果与讨论

2.1 UV分析结果

测得的虫草素A和化合物B的紫外光谱图如图2所示.图2中A、B分别为虫草素A、化合物B的UV图.解析如下[15]：虫草素A的紫外光谱中有两个强吸收峰，分别在213 nm和260 nm附近，而化合物B的213 nm吸收峰消失，化合物B最大吸收峰是280 nm.由虫草素A和化合物B的分子结构可以解释吸收峰的数值解释.对虫草素A结构来说，213 nm附近的强吸收可以解释为分子结构中的-OH和-NH-的n-σ*跃迁所致，260 nm的强吸收可以解释为分子结构中的芳香环的π-π*跃迁所致.而化合物B结构中，280～290 nm处有吸收峰，可以解释为分子结构中新接入的基团上的共轭二烯结构的π-π*跃迁所致.图C为络合物C的紫外光谱图，络合物C溶液的最大吸收峰波长均为 521 nm，均符合纳米金溶液吸光特征[16-17]，可确定此络合物C溶液中含有纳米金颗粒.

图2 虫草素A、化合物B和络合物C的紫外光谱图

2.2 FTIR分析结果

图3为虫草素A、化合物B及络合物C的红外谱图各化合物的光谱数据如下[15]:

图3 虫草素A、化合物B和络合物C的红外光谱图

2.3 NMR分析结果

各化合物的光谱数据及分析结果如下[15]，以下数据测试说明为1H-NMR和13C-NMR：

虫草素A的1H-NMR：(500 MHz, DMSO-d6)δ 8.36(1H，s, 2-H), 8.15(1H,s,8-H), 7.29(2H,s,-NH2), 5.88(1H,d,1′-H), 5.67(1H,d,2′-H), 5.17(1H,t,4′-H), 4.58(1H,dt,2′-OH), 4.36(1H,dp,4′-OH), 3.71-3.50(2H，ddd,5′-CH2), 2.29-2.45(1H,ddd,3′-CH2).13C-NMR：(125 MHz, DMSO-d6)δ156.52(1C,6-C), 152.90(1C,2-C),149.31(1C,4-C), 139.52(1C,8-C), 119.54(1C,5-C), 91.24(1C,1′-C),81.15(1C,4′-C), 75.05(1C,2′-C), 63.07(1C,5′-C), 34.52(1C,3′-C).

化合物B的1H-NMR谱图数据: δ 8.25(1H,s, 2-H), 8.14(1Hs,8-H),7.98-7.23(3H,dd,5′-CH2), 7.33(2H,s,6-NH2), 5.96(1H，d,1′-H), 5.88(1H,d,2′-H), 4.72-4.45(4H,dp, 2′-OH,4′-H,5′-CH2), 2.42-2.11(2H,ddd,3′-CH2).13C-NMR：δ 161.76(1C,-COO), 156.52(1C,2-C), 153.17(1C,4-C), 149.48(1C,8-C), 134.59-128.75(4,5′-CH=), 119.39(1C,5-C), 91.34(1C,1′-C), 77.99(1C,4′-C), 74.84(1C,2′-C), 66.25(1C,5′-C), 35.22(1C,3′-C).白色粉末, 产率为52.0%，M.P:204～205 ℃.[M+H]+=362.0928

2.4 XRD分析结果

络合物的XRD结果如图4所示.

图4 络合物C的XRD分析

与JCPDS标准卡对照，已负载金纳米粒子的谱图在32.26°、46.30°、57.34°，有三处明显的Au晶体特征峰，分别是(200)，Au(220)，Au(311)，的特征衍射峰[19].依据Scherrer公式可算化合物B-AuNPs295nm.

3 结 语

纳米金能够作为良好的载体，主要因为其具有表面易修饰性，进而可以通过络合到其他化合物结构上来增加药理活性，从而被越来越多应用于医药研究.在经过不相同的配体修饰后的纳米金颗粒，可以使其拥有检测、靶向、治疗，以及在生物领域的一系列应用，并且通过进行小分子络合纳米金也可以减少传统抗癌药对正常细胞的毒性，提高抗癌药物的抗癌作用效果.本文制备了虫草素的衍生物，将其修饰至纳米金表面，并对其结构进行表征，本实验的研究为后续虫草素衍生物活性分析奠定基础，为今后肿瘤治疗领域创造条件.