连夏配方颗粒对心肌梗死大鼠室颤阈值和连接蛋白43重构的影响

李赛赛 李平 康楠 李芳赫 李家立

摘要 目的：探讨连夏配方颗粒对心肌梗死大鼠室颤阈值和连接蛋白43（Cx43）重构的影响。方法：通过结扎大鼠左冠状动脉前降支建立心肌梗死模型，将造模成功的大鼠随机分为模型组、连夏配方颗粒高、中、低剂量组和美托洛尔组，另设假手术组。干预30 d后采用在体程控电刺激检测大鼠室颤阈值;RT-PCR法检测左心室心梗边缘区P38mRNA、Cx43mRNA的表达;免疫组织化学染色检测Cx43的密度和分布;酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。结果：与假手术组比较，模型组大鼠室颤阈值显著降低，Cx43mRNA表达下降，分布紊乱，血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA表達显著增加（P<0.01）;与模型组比较，连夏配方颗粒高、中剂量组大鼠室颤阈值提高（P<0.01，P<0.05），Cx43mRNA表达增加（P<0.05），Cx43分布改善，血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA的表达显著降低（P<0.01）。结论：连夏配方颗粒可提高心梗大鼠室颤阈值，其机制可能与减轻炎症反应，改善连接蛋白43重构有关。

关键词 连夏配方颗粒;心肌梗死;连接蛋白43;室颤阈值

Effect of LianXia Formula Granule on Ventricular Fibrillation Threshold and Connexin 43 Remodeling in Rats with Myocardial Infarction

LI Saisai1，LI Ping1，KANG Nan2，LI Fanghe1，LI Jiali2

（1 Beijing University of Chinese Medicine，the Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China; 2 Affiliated Hospital of Jining Medical University，Jining 272029，China）

Abstract Objective：To investigate the effect of LianXia Formula Granule on ventricular fibrillation threshold and connexin 43（Cx43）remodeling in myocardial infarction rats.Methods：The model of myocardial infarction was established by ligating the left anterior descending coronary artery of the rat，and the successfully modeled rats were randomly divided into a model group，a Lianxia formula granule high，medium，and low dose group，and a metoprolol group，and a sham operation group.After 30 days of intervention，the ventricular fibrillation threshold was detected by in vivo programmed electrical stimulation; RT-PCR method was used to detect the expression of P38mRNA and Cx43mRNA in the marginal zone of left ventricular myocardial infarction; the density and distribution of Cx43 were detected by immunohistochemical staining; the content of serum TNF was detected by ELISA method.Results：Compared with the sham operation group，the ventricular fibrillation threshold of rats in the model group was significantly reduced，the expression of Cx43mRNA was decreased，the distribution was disordered，the content of serum TNF-α and the expression of myocardial P38mRNA were significantly increased（P<0.01）.Compared with the model group，the ventricular fibrillation threshold of rats in the high and medium dose groups of Lianxia formula particles increased（P<0.01，P<0.05），the expression of Cx43mRNA increased（P<0.05），the distribution of Cx43 was improved，and the level of serum TNF-α and the expression of P38mRNA in myocardium was significantly reduced（P<0.01）.Conclusion：LianXia Formula Granule can raise ventricular fibrillation threshold，and its mechanism is related to reducing inflammation and improving connexin 43 remodeling.

Keywords LianXia Formula Granule; Myocardial infarction; Connexin 43; Ventricular fibrillation threshold

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.04.008

急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction，AMI）是严重威胁人类健康的常见心血管疾病。AMI后恶性室性心律失常（Ventricular Arrhythmia，VA）是AMI患者死亡的主要原因，因此，防治AMI后VAs具有重要的现实意义。连接蛋白43（Connexin43，Cx43）是心室表达最丰富的缝隙连接蛋白。心肌梗死后，Cx43的表达数量、分布和结构出现了显著性异常改变，称为Cx43重构[1-2]，影响电冲动在心室肌细胞间传导的连续性、一致性，增加心律失常的诱发倾向。

连夏配方颗粒是李平教授根据黄连温胆汤化裁而来，具有清热化痰、宁心定悸的功效。我们前期研究证明，连夏配方颗粒能够改善心肌梗死大鼠心脏自主神经重构[3]，有效减少肾上腺素诱导的实验性大鼠心律失常的持续时间[4]。但是对连夏配方颗粒干预心肌梗死后室颤阈值的作用及连接蛋白43重构的影响有待进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体（SPF）级健康雄性SD大鼠，体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：SCXK（京）2016-0006。实验得到济宁医学院附属医院伦理委员会批准。飼养环境清洁，室温22～24 ℃，相对湿度45%～65%，自由饮水，普通饲料喂养，光照周期12 h/12 h明暗交替。

1.1.2 药物 连夏配方颗粒由黄连6 g、姜半夏6 g组成，均由北京康仁堂药业有限公司生产，北京中医药大学第三附属医院提供。根据人和动物等效剂量换算法计算得到：实验大鼠连夏配方颗粒高剂量为189.00 mg/kg、连夏配方颗粒中剂量94.50 mg/kg、连夏配方颗粒低剂量47.25 mg/kg。酒石酸美托洛尔片（阿斯利康制药有限公司，生产批号：190710）[5]。

1.1.3 试剂与仪器 4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司，批号：P1110-100）;大鼠TNF-alpha ELISA试剂盒（RayBiotech公司，美国，批号：ELR-TNFA-1）;小鼠单克隆Connexin 43抗体（Abcam公司，英国，批号：ab11369）;HRP标记抗小鼠lgG（Easybio公司，美国，批号：80921227）;小动物呼吸机（上海奥尔科特生物有限公司，型号：ALC-V8S）;多导生理记录仪（Adinstruments公司，澳大利亚，型号：PowerLab）;实时荧光定量PCR仪（ABI，美国，型号：QuantStudio 6）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 建立心肌梗死模型：采用结扎左冠状动脉前降支的方法制备心肌梗死大鼠模型[6]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠45 mg/kg进行麻醉，备皮后经口气管插管连接小动物呼吸机，在第3～4肋骨之间逐层开胸，在左心耳下2 mm处用5-0手术线穿线并结扎左冠状动脉前降支，结扎点以下的心肌组织变苍白，心肌搏动减弱，逐层关胸，心电图Ⅱ导联的ST段呈现弓背向上样抬高作为评判手术成功的标志。假手术组平行手术操作，但只穿线不结扎。术后腹腔注射青霉素预防感染。术后24 h，将造模成功的50只存活大鼠随机分为模型组、连夏配方颗粒高中低剂量组、美托洛尔组各10只，另设假手术组8只。

1.2.2 给药方法 连夏配方颗粒高中低剂量组每日灌胃连夏配方颗粒分别为189.00 mg/kg、94.50 mg/kg、47.25 mg/kg;美托洛尔组每天灌胃酒石酸美托洛尔片24 mg/100 g，假手术组和模型组给予生理盐水灌胃，大鼠灌胃容积均为1 mL/100 g，1次/d，连续30 d。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 室颤阈值检测 治疗30 d后，采用在体程控电刺激方法检测室颤阈值[7]。大鼠腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠麻醉后连接气管插管，连接PowerLab多导生理记录仪，记录Ⅱ导联心电图。开胸暴露心脏，将刺激电极的正极置于心尖部，负极置于左室前壁右侧心梗边缘区，刺入深度约l mm，两电极相距3 mm，刺激器发出的串刺激，每串10个刺激波，脉宽5 ms，刺激频率30 Hz，初始刺激电压1 V，增幅0.5 V，测量能够诱发出室颤的最小刺激电压，即为室颤阈值。

1.2.3.2 免疫组织化学检测Cx43分布和表达 完成上述实验后，将大鼠麻醉处死，在大鼠左心室心肌梗死边缘区获取心肌组织，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋后制成厚度为4 μm的石蜡切片。经二甲苯脱蜡、水化、抗原修复，滴加一抗（Cx43 1∶100）37 ℃孵育1 h，再滴加二抗室温孵育20 min，加入DAB显色液，自来水冲洗，苏木精染色液孵育1 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，凝胶树酯封片。采用Image-ProPlus 6.0软件分析，每张切片在心梗边缘区随机选取6个视野计算平均吸光度，求平均值作为各标本Cx43的表达值。

1.2.3.3 实时PCR检测Cx43mRNA、P38mRNA转录水平 应用Premier5.0软件进行引物设计，Cx43引物：上游5′-GGCAAGGTGAAAATGAGGGG-3′，下游5′-AAAGCGAGAGACACCAAGGA-3′，长度242 bp;P38引物：上游5′-CACTGCTGCTTCCTCACTCCA-3′，下游5′-AGGGTTCAGGTGCTCTGTTCG-3′，长度：99 bp;GAPDH引物：上游5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′，长度253 bp。采用trizol试剂进行RNA提取，并合成cDNA，再进行cDNA扩增。反应条件为：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。PCR结束后获取Ct值，并计算2-△△Ct值，分析表达差异。

1.2.3.4 ELISA检测血清TNF-α含量 按照试剂盒说明书检测大鼠血清TNF-α含量。于ELISA检测仪450 nm处，以空白孔调零后测各孔吸光度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，若数据符合正态分布，方差齐，用单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间比较用LSD法;若数据不符合正态分布，则用非参数检验，组间比较用Kruskal-Wallis检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠室颤阈值比较 在体程控电刺激实验，与假手术组比较，模型组大鼠室颤阈值显著降低（P<0.01）;与模型组比较，连夏配方颗粒高剂量组和美托洛尔组室颤阈值显著提高（P<0.01），连夏配方颗粒中剂量室颤阈值明显提高（P<0.05），连夏配方颗粒低剂量组未见明显降低（P>0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠心肌组织Cx43表达及分布比较 在免疫组织化学染色中Cx43被标记为棕褐色，细胞核被标记为淡蓝色。假手术组可见Cx43表达量丰富，界线清晰，多数成粗线状或短棒状排列，分布有高度的规律性，主要位于心肌长轴方向垂直的细胞端-端连接处，即闰盘部位，少数分布在心肌细胞侧-侧连接处;模型组Cx43表达明显减少，分布紊乱，呈细点状排列，多数弥散分布于胞质中，少量分布于细胞膜附近，与假手术组比较，模型组Cx43阳性表达的平均光密度显著降低（P<0.01）;连夏配方颗粒高、中劑量组和美托洛尔组Cx43表达明显增加，分布比较整齐，大部分界线清晰，成线状排列，与模型组比较，连夏配方颗粒高、中剂量组和美托洛尔组Cx43阳性表达的平均光密度显著增加（P<0.01）;连夏配方颗粒低剂量组Cx43表达增加，分布尚整齐，界线尚清晰，与模型组比较，连夏配方颗粒低剂量组Cx43阳性表达的平均光密度明显增加（P<0.05）。见图1，表2。

2.3 各组大鼠心肌组织Cx43mRNA和P38mRNA表达比较 与假手术组比较，模型组左心室心肌梗死边缘区Cx43mRNA的表达显著下降（P<0.01）;与模型组比较，美托洛尔组Cx43mRNA表达显著升高（P<0.01），连夏配方颗粒高、中剂量组Cx43mRNA表达明显升高（P<0.05），连夏配方颗粒低剂量组未见明显降低（P>0.05）。与假手术组比较，模型组大鼠心梗边缘区P38mRNA的表达显著增加（P<0.01）;与模型组比较，连夏配方颗粒高中低剂量组和美托洛尔组的P38mRNA表达有不同程度的下降（P<0.01，P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠血清TNF-α含量比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α显著升高（P<0.01）;与模型组比较，连夏配方颗粒高、中、低剂量组和美托洛尔组大鼠血清TNF-α均显著降低（P<0.01），差异有统计学意义。见表4。

3 讨论

Cx43是心室缝隙连接通道最主要的构成成分，在正常心室肌细胞中呈簇状分布，以细胞端对端分布为主，介导心肌细胞电信号和化学信号的传递[8]。心肌梗死后Cx43发生了重构现象心肌细胞Cx43表达水平显著降低，并且紊乱分布于细胞侧-侧连接处，形成了心肌梗死后心律失常的结构基础[9]。研究发现，Cx43表达减少程度与传导速度负相关，Cx43在心肌细胞的不均匀分布造成了电传导的不连续性和各向异性[10]。Cx43重构是心肌梗死后心律失常发生的重要因素。因此，改善Cx43重构是防治心肌梗死后室性心律失常的潜在干预靶点。

研究表明，诸多炎症介质参与调节心脏Cx43重构。炎症反应是心肌梗死病理过程的基本特征，TNF-α是人体主要的炎症介质，在正常心脏中不表达或很少表达，心肌发生炎症反应时，TNF-α大量释放，能够加剧心肌细胞Cx43的降解[11]。有学者研究，TNF-α可能通过P38MAPK激酶信号通路调控Cx43的表达[12]。Surinkaew等[13]研究显示，在心肌缺血时，p38MAPK被激活，能够减少Cx43表达，进一步影响缝隙连接功能，进而导致心律失常的发生。本研究发现，模型组大鼠血清TNF-α和心肌P38mRNA表达水平显著升高，Cx43mRNA表达显著下降，免疫组化结果也提示心肌Cx43分布紊乱，在体程控电刺激提示室颤阈值降低，这一结果与前期研究相一致。

连夏配方颗粒由黄连与姜半夏两味药组成，专为冠心病痰热证而立。黄连清心热、泻心火，姜半夏降逆气、化痰浊，全方寒温并治，辛开苦降，药少力专，共奏清热化痰、宁心定悸之功。现代药理研究表明，黄连具有抗心律失常、抗炎、抗凋亡、降血糖、改善心肌缺血缺氧状态等作用[14-15]。半夏具有抗炎、抗心肌缺血、抗心律失常、抗血小板聚集、调节脂质代谢、镇静等作用[16]。本研究结果表明，连夏配方颗粒高、中剂量组能够提高心肌梗死大鼠室颤阈值，增加Cx43mRNA的表达，改善Cx43的分布，减少了血清TNF-α的含量和心肌P38mRNA的表达。从而推测，连夏配方颗粒应用具有提高室颤阈值的作用，其机制可能与减轻炎症反应，改善Cx43重构有关。

有报道，心肌梗死后自主神经活性的改变对Cx43重构有重要作用[17]。我们团队基础实验证实连夏配方颗粒能够调节心肌梗死后大鼠自主神经[3]，提示连夏配方颗粒提高室颤阈值可能与改善自主神经功能亦有关系，信号通路之间有复杂的关联，下一步可通过免疫组织化学等方法研究心脏自主神经与Cx43之间的相关性及连夏配方颗粒的干预疗效，进一步深入探讨连夏配方颗粒提高室颤阈值的作用机制。

参考文献

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（2020-05-18收稿 责任编辑：王明）