基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱和网络药理学的甘枣宁治疗非酒精性脂肪性肝病药效物质基础研究

王婉先，姚 曼，余 钦，李一璇，凌昌全,*

1.上海中医药大学，上海 201203

2.海军军医大学中医系，上海 200433

3.海军军医大学附属长海医院 中医肿瘤科，上海 200433

4.上海中医药大学附属岳阳医院，上海 200437

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）发病率日益升高，已成为最常见的慢性肝脏疾病之一[1]。海军军医大学附属长海医院中医科研发的甘枣宁复方由大枣、山药、山楂、佛手、荷叶、玉米须6 味中药组成，具有疏肝、健脾、调脂的功效，对NAFLD 疗效显著[2-3]。前期研究[4]发现，甘枣宁治疗NAFLD 具有多成分、多靶点、多通路的特点，涉及对营养物质水平的调节、抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的激活、调控活性氧代谢等生物学过程。由于网络药理学数据库主要基于文献报道，在药材炮制过程中，其所含化学成分与原饮片可能存在差异[5]。因此，本研究以超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）鉴定数据为依据，进行网络药理学分析，并考察甘枣宁关键活性成分的抗炎作用，为系统分析甘枣宁治疗NAFLD 的药效物质基础提供依据。

1 材料

1.1 细胞

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 购自中国科学院上海细胞库。

1.2 饮片

大枣（批号200214-1）、山药（批号200505-1）、山楂（批号200417-1）、佛手（批号200417-1）、荷叶（批号200320-1）购自安国市同德中药材有限公司，玉米须（批号570180701）购自北京宏济药业有限公司，经中国科学院大连化学物理研究所杨小平副研究员鉴定分别为鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实、薯蓣科植物薯蓣Dioscorea oppositaThunb.的干燥根茎、蔷薇科植物山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果实、芸香科植物佛手Citrus medicaL.var.sarco-dactylisSwingle 的干燥果实、睡莲科植物莲Nelumbo nuciferaGaertn.的干燥叶、禾本科植物玉蜀黍Zea maysL.的干燥花柱和柱头。

1.3 药品与试剂

对照品(S)-N-衡州乌药碱、(R)-N-衡州乌药碱、N-去甲基亚美罂粟碱、O-去甲基荷叶碱、(-)-表儿茶素和N-去甲基荷叶碱为本实验室自制，经HPLC检测质量分数均≥98%；质谱级乙腈（批号203500）和甲酸（批号202674）购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；DMEM 培养基（批号8120423）购自美国Gibco 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号ST1276）、一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒（批号11020201014）购自碧云天生物技术有限公司；青霉素-链霉素溶液（批号1936917）、PBS 缓冲液（批号2026067）购自以色列BI 公司；胎牛血清（批号ST180125）购自德国PAN-Biotech 公司；LPS（批号L6529）购自美国Sigma 公司；小白菊内酯（批号I1206051）购自阿拉丁生化科技股份公司。

1.4 仪器

Acquity UPLC®I-Class 系统（美国Waters 公司）；1290 Infinity II UPLC、6545 Q-TOF-MS/MS（美国Agilent 公司）；BWS-27 型精密恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；L550 型台式离心机（上海卢湘仪有限公司）；311 型CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；EnSight 酶标仪（美国PerkinElmer 公司）；HYC-290 型医用冷藏箱（青岛海尔特种电器有限公司）。

2 方法

2.1 甘枣宁水煎液的制备

称取大枣饮片240 g、山药饮片240 g、山楂饮片180 g、佛手饮片180 g、荷叶饮片120 g、玉米须饮片120 g，加入8 L 纯水，浸泡30 min，100 ℃煎煮30 min，收集水煎液；加入8 L 纯水，100 ℃煎煮20 min；合并2 次水煎液，过500 nm 陶瓷膜澄清，在进膜压0.33 MPa、出膜压0.26 MPa 的条件下进行澄清滤过，少量多次补水，收集透过液与截留液。将上述澄清液置于旋转蒸发仪中浓缩成相对密度为1.0～1.2 的浸膏，于真空干燥箱中干燥。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取对照品(S)-N-衡州乌药碱、(R)-N-衡州乌药碱、N-去甲基亚美（杏黄）罂粟碱、O-去甲基荷叶碱、(-)-表儿茶素、N-去甲基荷叶碱适量，溶于DMSO 分别配制成100 mmol/L 对照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析

2.3.1 色谱条件 BEH Shield RP18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～15 min，2%～90%B；体积流量为0.4 mL/min；柱温为30 ℃；进样量为1 μL。

2.3.2 梯度洗脱程序优化 在BEH Shield RP18色谱柱上调整梯度洗脱程序，优化对甘枣宁水煎液的分离效果。梯度1：0～15 min，2%～90% B。梯度2：0～9 min，2%～40% B；9～10 min，40%～0% B。梯度3：0～2 min，0% B；2～10 min，0%～40% B；10～12 min，40%～90% B。梯度4：0～2 min，0%B；2～4 min，0%～10% B；4～13 min，10%～35%B；13～15 min，35%～90% B。

2.3.3 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；正、负离子全扫描模式；干燥气温度为320 ℃；干燥气体积流量为8 L/min；雾化气压力为35 psi（1 psi＝6.895 kPa）；鞘气温度为350 ℃；鞘气体积流量为11 L/min；毛细管电压为＋3500 V 和-3000 V；碎裂电压为135 V；碰撞电压为65 V；碰撞能为20 eV；一级质量扫描范围为m/z100～1300，二级质量扫描范围为m/z50 ～1000 ； 数据采集模式为Auto-MS/MS。

2.3.4 化学成分鉴定 采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对甘枣宁水煎液进行分析，比较甘枣宁水煎液在正负离子模式下的提取离子流图，利用高分辨质谱的精确相对分子质量信息，确认化合物的分子式，随后利用二级质谱的碎片信息，结合文献报道的裂解规律对化合物结构进行推测，最后与文献中的化合物碎片信息比对确认。

2.4 甘枣宁提取液中活性成分及疾病靶点的筛选

采用TCMSP 平台（https://tcmspw.com/tcmsp.php）[6]对甘枣宁水煎液鉴定出的化合物逐一进行靶点检索。以“NAFLD”作为关键词，通过OMIM平台（https://www.omim.org）、DisGeNET 平台（https://www.disgenet.org/）[7]、GeneCards 数据库（https://www.genecards.org/）[8]检索NAFLD 相关靶点。DisGeNET 数据库纳入系统评分＞0.01 的靶点，GeneCards 数据库纳入系统评分＞45.475 的靶点，将各数据库靶点合并去重，名称格式统一，获得交集基因数据集。

2.5 蛋白质与蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建与关键靶点筛选

采用STRING 数据库[9]对甘枣宁潜在靶点与疾病靶点进行PPI 分析，上传交集基因数据集，选择物种为“Homo sapiens”，隐藏游离节点，采用Cytoscape 3.6.1 软件[10]绘图。

2.6 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

采用Metascape 数据库对交集基因进行GO 分析和KEGG 分析[11]，将所得结果进行绘图分析。采用Cytoscape 3.6.1 软件ClueGo 插件[12]，录入潜在靶点和疾病潜在相关靶点交集，进行GO 分析，得出生物过程（biological process，BP），选择物种为“Homo sapiens”，选择合并相似功能，统计P＜0.05 的通路，GO 网络连接评分选择0.45，绘制关键BP 富集图，将关键靶点与之联系，并根据占比情况绘制饼状图。

2.7 甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞上清液中NO水平的影响

取处于对数生长期的 RAW264.7 细胞，以2×104/孔接种至96 孔板中，培养24 h。设置对照组、模型组、小白菊内酯（5 μmol/L）组、(S)-N-衡州乌药碱（100 μmol/L）组、(R)-N-衡州乌药碱（100 μmol/L）组、N-去甲基亚美罂粟碱（100 μmol/L）组、O-去甲基荷叶碱（100 μmol/L）组、(-)-表儿茶素（100 μmol/L）组、N-去甲基荷叶碱（100 μmol/L）组和甘枣宁水煎液（2.5 mg/mL）组。“2.2”项下各对照品溶液分别用培养基稀释至相应浓度；“2.1”项下甘枣宁水煎液样品用水配制成质量浓度为100 mg/mL 的储存液，用培养基稀释至相应质量浓度。各给药组加入90 μL 相应药物，预处理1 h；模型组和各给药组再加入10 μL LPS（1 μg/mL），对照组加入含DMSO 的DMEM 培养基，培养24 h，按试剂盒说明书检测细胞上清液中NO 水平。

2.8 甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞存活率的影响

设置对照组、N-去甲基荷叶碱（200、100、50 μmol/L）组和甘枣宁水煎液（10.0、5.0、2.5 mg/mL）组。按“2.7”项下方法处理细胞，弃去培养基，避光加入100 μL CCK8 溶液，培养1 h，采用酶标仪测定450 nm 处吸光度（A）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝A给药/A对照

3 结果

3.1 甘枣宁水煎液中化学成分的鉴定

通过梯度条件的优化，确定了最佳的流动相条件为梯度4，在质谱分析时为了确认样品在色谱柱上的残留情况，增加了5 min 90% B 冲洗时间。甘枣宁水煎液的提取离子流图见图1，甘枣宁水煎液在正离子模式下的响应优于负离子模式，正负离子模式下的离子化效率不同。通过对正负离子模式的成分解析，共获得96 个主峰化合物，包括野漆树苷、山柰素-3-O-己糖苷、金丝桃苷和香叶木素-7-O-葡萄糖苷等34 个黄酮类化合物，以及氨基酸类、单糖类、酚酸类、核苷类、花青素类、柠檬苦素类、生物碱类、有机酸类化合物。

图1 甘枣宁水煎液在正离子模式(A)和负离子模式(B)下的提取离子流图Fig.1 Extraction ion chromatogram of Ganzaoning Decoction in positive ion mode(A)and negative ion mode(B)

3.2 甘枣宁治疗NAFLD 的网络药理学分析

续表1

预测出的31 个活性成分见表1。如图2所示，甘枣宁治疗NAFLD 共42 个靶点，“中药-成分-靶点-通路”网络见图3。如图4所示，PPI 网络分析得出白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、趋化因子配体 2（chemokine C-C motif ligand 2，CCL2）、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）等靶点相关性较强。

表1 甘枣宁活性成分Table 1 Active compounds of Ganzaoning

图2 甘枣宁治疗NAFLD 的韦恩图Fig.2 Venn diagram of Ganzaoning in treatment of NAFLD

图3 “中药-成分-靶点-通路”网络Fig.3 “Traditional Chinese medicine-ingredient-target-pathway” network

图4 甘枣宁治疗NAFLD 的PPI 网络Fig.4 PPI network of Ganzaoning in treatment of NAFLD

如图5所示，甘枣宁治疗NAFLD 主要涉及糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）及其糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）通路、血流剪切应力与动脉粥样硬化、程序性坏死等通路。如图6所示，甘枣宁治疗NAFLD 涉及外源性凋亡信号通路、细胞对LPS反应、细胞对活性氧的反应等20 个BP 条目，神经元胞体、真空裂解、内吞小泡等6 个细胞组成（cellular component，CC）条目，核受体活性、蛋白酶结合、转氨酶活性等10 个分子功能（molecular function，MF）条目。ClueGO 进一步对BP 富集进行分析见图7，NOS3 处于核心位置，与细胞对LPS的反应密切相关。

图6 甘枣宁治疗NAFLD 的GO 分析Fig.6 GO analysis of Ganzaoning in treatment of NAFLD

图7 ClueGO BP 富集分析Fig.7 ClueGO biological process enrichment analysis

3.3 甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞上清液中NO水平的影响

如图8所示，与对照组比较，模型组细胞上清液中NO 水平显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，小白菊内酯、(S)-N-衡州乌药碱、O-去甲基荷叶碱、(-)-表儿茶素、N-去甲基荷叶碱和甘枣宁水煎液组细胞上清液中NO 水平均显著降低（P＜0.001），表明(S)-N-衡州乌药碱、O-去甲基荷叶碱、(-)-表儿茶素和N-去甲基荷叶碱是甘枣宁抗炎的重要药效成分，其中N-去甲基荷叶碱抗炎活性最强。

图8 甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞上清液中NO 水平的影响Fig.8 Effect of Ganzaoning Decoction on NO level in supernatant of RAW264.7 cells

对N-去甲基荷叶碱和甘枣宁水煎液进行抗炎活性剂量检测，如图9所示，从剂量效应曲线计算获得N-去甲基荷叶碱的IC50值为（105.41±12.08）μmol/L，甘枣宁水煎液的IC50值为（703.80±120.35）μg/mL。

图9 不同剂量N-去甲基荷叶碱和甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞上清液中NO 水平的影响Fig.9 Effect of N-nornuciferine and Ganzaoning Decoction with different concentrations on NO level in supernatant of RAW264.7 cells

3.4 甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞存活率的影响

如图10所示，与对照组比较，N-去甲基荷叶碱（200、100 μmol/L）组细胞存活率显著降低（P＜0.01、0.001），各剂量甘枣宁水煎液均无细胞毒性，表明甘枣宁具有较好的安全剂量范围，符合药食同源的特征。

图10 N-去甲基荷叶碱和甘枣宁水煎液对RAW264.7 细胞存活率的影响Fig.10 Effect of N-nornuciferine and Ganzaoning Decoction on survival rate of RAW264.7 cells

4 讨论

中草药调脂具有明显优势[13]。甘枣宁能够显著改善NAFLD 患者血脂水平，经甘枣宁颗粒干预后的脂肪肝患者的中医证候积分明显低于对照组，肝功能及血脂指标改善显著大于对照组[2-3]；甘枣宁显著改善大鼠肝组织脂肪变性[14]。目前针对甘枣宁的相关成分鉴定与药效基础研究尚浅，本研究以UPLC-Q-TOF-MS/MS 技术分析出甘枣宁所含468个化学成分，鉴定了96 个化学成分，较此前单纯依据网络药理学数据库得到的84 个成分，更加丰富全面。金丝桃苷对抗化学损害、抗病毒、抑制自由基脂质过氧化、保肝护肝等具有显著作用[15-16]；异牡荆素可通过抑制炎性反应和氧化反应来防御LPS/D-半乳糖胺诱导的肝损伤[17]；荷叶生物碱类化合物具有良好的抗炎[18]、调脂，抑制前脂肪细胞增殖的功能[19]，可以显著抑制参与多种内源物和外源物代谢的细胞色素P4502D6（cytochrome P4502D6，CYP2D6）酶[20]。

网络药理学分析发现甘枣宁治疗NAFLD 的活性成分主要来自荷叶、山楂、佛手和大枣，结合PPI分析发现IL-6、TNF、PPARG、CCL2、NOS3 等靶点相关性较强。研究发现，NAFLD 形态学病变严重程度较高的III 类肥胖患者在肝脏等白色脂肪组织中表现出较高的IL-6 和TNF-α 表达[21]。脂肪变性的原代肝细胞以脂肪形成的特征释放促炎细胞因子IL-6[22]。NAFLD 中核因子的改变与脂肪变性、氧化应激和炎性介质（如TNF-α、IL-6）有关[23]。患有NAFLD 的病态肥胖患者血清中TNF-α 水平显著升高[24]。PPARG 是调节脂肪细胞分化、胰岛素敏感性和脂质代谢的核受体[25]。在NAFLD 发生期间，肝脏中CCL2 及其受体表达上调，促进巨噬细胞蓄积，从而发生炎性反应、纤维化和脂肪变性[26]。

KEGG 富集分析甘枣宁治疗NAFLD 主要涉及糖尿病并发症中的AGE-RAGE 通路、癌症、乙型肝炎、血流剪切应力与动脉粥样硬化、程序性坏死等通路。AGEs-RAGE 轴参与肝损伤和NAFLD 的发病机制[27]。RAGE 途径能够调节肝损伤、炎性反应和纤维化[28]。NAFLD 是非钙化斑块的独立危险因素[29]。GO 分析发现甘枣宁治疗NAFLD 涉及外源性凋亡信号通路、细胞对LPS 反应、细胞对活性氧的反应等BP 条目，神经元胞体、真空裂解、内吞小泡等CC 条目，核受体活性、蛋白酶结合、转氨酶活性等MF 条目。NAFLD 的发生与LPS 水平升高有关，动物长期sc LPS 和高脂饮食可通过核因子-κB 抑制物激酶ε（nuclear factor-κB inhibitor kinase ε，IKKε）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号传导诱发NAFLD[30]。线粒体的改变是导致NAFLD 的关键因素，β 氧化水平降低，脂肪生成的增加，会导致脂质在肝细胞中的积累，随后产生活性氧和肝细胞损伤，激活Kupffer 细胞和肝星状细胞，从而促进肝脏炎性反应和纤维化[31]。NAFLD 中核受体如PPAR、组成性雄甾烷受体（constitutive androstane receptor，CAR）、孕烷X 受体（pregnane X receptor，PXR）、肝X 受体（liver X receptor，LXR）和法尼醇X 受体（farnesoid X receptor，FXR）的失调可能影响肝脏中内源性和外源性化学物质的代谢[32]。

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 与网络药理学[33]结果，进一步考察甘枣宁及6 种荷叶生物碱的抗炎活性。NO 是一种脂溶性气体物质，在肝脏中存在典型的合成通路，能够调节胃肠道平滑肌舒张功能，增加通透性，促使细菌内毒素入侵，与NAFLD 的发生发展密切相关[34-35]。NO 由NOS 催化产生，在体内表现为神经型、诱导型和内皮型，其中内皮型NOS 能够通过干预肝脏线粒体影响NAFLD 疾病进程[36]。ClueGO 分析发现，NOS3 处于核心位置，与细胞对LPS 的反应密切相关。NOS3 是小鼠高脂喂养期间肝胰岛素抵抗和高胰岛素血症发生的关键调节剂，同时也是影响NF-κB 活化的关键因子[37]，与网络药理学预测结果一致，甘枣宁可能通过NOS3发挥治疗NAFLD 的作用。

中医药治疗肝脏疾病具有显著疗效[38]，在探索甘枣宁治疗NAFLD 的作用机制过程中，面临着中药方剂多成分、多靶点的难点。本研究通过UPLC-Q-TOF-MS/MS 与网络药理学明确物质基础，再通过体外实验验证，与临床实践互相印证，探讨了甘枣宁治疗NAFLD 的药效物质基础，后续研究需将证候、药物配伍关系、量效等信息融入网络药理学[39]，完善数据库信息，衡量结果的可靠性，为今后进一步挖掘方剂的有效性奠定基础。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突