基于UHPLC-Q-Orbitrap和网络药理学的灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的机制研究

李卓伦，杨彦涛，孙 志，师莹莹，高一乔，贾雪冬，康 建，周 霖，贾清泉，张晓坚*

1.郑州大学第一附属医院药学部，河南 郑州 450052

2.河南省精准临床药学重点实验室，河南 郑州 450052

灯盏生脉胶囊由灯盏细辛、麦冬、人参和五味子4 味药材提取加工制成[1]，具有益气养阴、活血健脑的功效，临床上常用于治疗中风后遗症、高脂血症、冠心病心绞痛、缺血性心脑血管疾病等病症[2-4]。但灯盏生脉胶囊药效物质的相关研究匮乏，严重限制了对其在临床上精准用药的指导。因此亟需建立一种高通量、高分辨率、高灵敏度且能科学预测其在人体内作用靶点的方法对灯盏生脉胶囊药效物质基础进行分析。

超高效液相色谱-四级杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）因其优异的分辨能力、良好的质量准确度和灵敏度，可在一个分析周期内获得大量高精度的一级、二级质谱信息，现已逐步成为中药药效成分快速准确鉴定的重要手段。网络药理学具有整体性、系统性的特点，其融合系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，进行“疾病-表型-基因-药物”多层次网络的构建，从整体的角度探索药物与疾病间的关联，发现药物靶标，指导合理用药[5-6]。

本实验利用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术结合网络药理学对灯盏生脉胶囊中化合物成分构成及其相关靶点、疾病进行了鉴定分析。通过利用高分辨质谱获得的精确相对分子质量、保留时间及碎片离子信息，共获得黄酮类、木脂素类、酚酸类、皂苷类和其他类共5 类30 种化合物，并结合网络药理学分析心绞痛相关的靶点，构建灯盏生脉胶囊“化合物-靶点-疾病”网络，最终获得对治疗心绞痛起药效作用的化合物。本实验为进一步明确灯盏生脉胶囊药效物质基础和指导临床合理用药奠定了坚实的理论基础。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

UHPLC-Q-Orbitrap 液相色谱-质谱联用系统：Ultimate 3000 超高效液相色谱（Dionex 公司，美国）串联 Q-Exactive 型高分辨质谱（Thermo FisherScientific 公司，美国）；WatersACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters 公司，美国）；Master-E 型超纯水机（上海和泰仪器有限公司）；New Classic MS 型十万分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo 上海有限公司）；MDS-6G 型多通量微波消解/萃取系统（上海新仪微波化学科技有限公司）。

1.2 试剂

灯盏生脉胶囊（云南生物谷药业股份有限公司，批号Z20026439）；对照品琥珀酸（批号MUST-17030502）、原儿茶酸（批号MUST-16032112）、绿原酸（批号MUST-16031610）、原儿茶醛（批号MUST-15091608）、咖啡酸（批号MUST-15090803）、阿魏酸（批号MUST-15091605）、木犀草素（批号MUST-16011015）、芹菜素（批号MUST-16061301）、山柰酚（批号MUST-16032801）、戈米辛D（批号MUST-17120902）、戈 米 辛 J（批 号MUST-17102802）、人参皂苷Rg3（批号MUST-17030711）、五味子酚（批号MUST-17040209）、五味子甲素（批号MUST-17022401）、五味子乙素（批号 MUST-17031606）、五味子丙素（批号MUST-17031816）均购于成都曼思特生物科技有限公司；以上对照品经峰面积归一化质量分数大于99%。甲酸、甲醇及乙腈为色谱纯级，美国Fisher 公司；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱为 Waters ACQUITY UPLC®BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱：0～1 min，5% A；1～5 min，5%～35% A；5～15 min，35%～40% A；15～25 min，40%～50% A；25～32 min，50%～65% A；32～42 min，65%～100%A；42～47 min，100% A；47～47.1 min，100%～5% A；47.1～50 min，5% A；体积流量为0.2 mL/min；进样量5 μL；柱温40 ℃。

2.1.2 质谱条件 UHPLC-Q Exactive 液质联用仪离子源采用HESI 源（heated ESI），辅助气体积流量为10 arb，辅助气温度为300 ℃，离子传输管温度320 ℃；正离子模式下：鞘气体积流量为40 arb，喷雾电压为3.50 kV；负离子模式下：鞘气体积流量为38 arb，喷雾电压为2.80 kV。扫描方式为正、负离子Full MS/dd-MS2 模式，其中包括1 次一级全扫描（分辨率为70 000 FWHM）和1 次数据依赖的二级扫描（分辨率为17 500 FWHM）2 个事件，质荷比窗口宽度设置为2，碰撞能梯度为20、50、100 eV，扫描范围m/z80～1200。

2.2 供试品溶液的制备

取灯盏生脉胶囊3 粒，去壳后，取内容物约1.0 g，精密称定后，置于具塞锥形瓶中，精密量取并加入纯甲醇50 mL，密塞并称定质量，微波萃取（功率600 W）17 min，摇匀后经0.22 μm 微孔滤膜滤过，即得样品溶液。

2.3 对照品溶液的制备

取各对照品约1.0 mg，精密称定后，分别置于10 mL 量瓶中，加入纯甲醉溶解并稀释至刻度，摇匀，最终制备成质量浓度为0.1 mg/mL 的单一对照品储备液；分别精密量取上述单一对照品储备液适量，将其混合后加入甲醇稀释，最终制备成各对照品质量浓度均为1 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.4 化合物结构分析

依照“2.1”项下优化后的色谱质谱条件进样后，根据高分辨质谱提供的准分子离子和加荷离子等信息推测并得到各成分的精确相对分子质量，经Xcalibar 3.0 软件拟合分子式，并与数据库进行比对，以对各色谱峰进行初步推测，再依据对照品、Mass Frontier 软件或参考文献、Mass Bank、Chemical Book等数据库提供的保留时间及高能碰撞下产生的多级碎片离子信息，进一步准确识别化学成分。

2.5 网络药理学分析

2.5.1 灯盏生脉胶囊成分-靶点预测 本研究以药物成分含量高低、是否为入血成分和文献报道有重要药理作用为依据进行生物活性成分筛选，通过ChemBioDraw Ultra 12.0 绘制各成分的结构并得到各化合物的Smile 号、InChIkey 号等相关信息，利用TCMSP 数据库、STITCH 数据库查找各成分对应的相关靶点，并剔除无相关靶点的成分。由于不同数据库对靶点命名存在不规范性，故借助Uniprot数据库将所有靶点名称统一为官方基因名（official gene symbol）。最后借助Cytoscape 3.6.1 软件构建“灯盏生脉胶囊”活性成分-靶点相互作用网络，以节点（node）表示成分和作用靶点，以边（edge）表示成分与靶点间的相互作用[7-9]。

2.5.2 心绞痛相关靶点的收集 以“angina”为检索词，通过OMIM 数据库、TDD 数据库、GAD 数据库、GeneCards 数据库、DigSee 数据库和DisGenet数据库对心绞痛相关靶点进行检索，删除重复得到心绞痛相关的疾病靶点[7-9]。

2.5.3 基于药物和疾病靶点交集网络的关键靶点筛选

（1）蛋白互作（protein protein interaction，PPI）网络的构建：通过借助Cytoscape 3.6.1 软件中BisoGenet 3.0.0 插件所包含的 Database of Interacting Proteins（DIP）、Biological General Respository for Interaction Datasets（BIOGRID）、Human Protein Reference Database（HPRD）、IntAct Molecular Interaction Database（INTACT）、Molecular Interaction Database（MINT）、Biomolecular Interaction Network Database（BIND）等6 种蛋白相互作用关系数据库，灯盏生脉胶囊“活性成分-靶点”的PPI 网络和“疾病-靶点”的PPI 网络得以构建。相关参数设置为：Organism：Homo sapiens（Human）；Map input identifiers list to：Gene identifiers only；Data settings:Protein Protein Interaction，勾选DIP/BIOGRID/HRPD/INTACT/MINT/BIN[7-9]。

（2）关键靶点筛选：利用Cytoscape 软件中的Merge 功能将两个PPI 网络进行整合提取其交集网络，并采用NetworkAnalyzer 功能对网络做拓扑结构分析，得到的网络连接度（Degree）值越高，表明该节点在网络中越重要；选择Degree 大于其中位数值两倍以上的节点作为关键候选靶点，然后基于CytoNCA插件计算网络节点的6个拓扑特征值度中心性（degree centrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closenesscentrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、网络中心性（network centrality，NC）和局部边连通性（localaverage connectivity，LAC）提取分析这些候选节点网络关系，这6 个拓扑结构特征值越大，在网络中越重要，选择以上6 个特征值均大于其相应中位数的节点作为核心靶点[7-9]。

3 结果

本研究鉴定得到黄酮类、木脂素类、酚酸类、皂苷类和其他类共5 类30 种化合物，供试品溶液的总离子流图见图1，化合物质谱信息见表1。

图1 供试品溶液总离子流图Fig.1 Total ion chromatography of test solution

表1 灯盏生脉胶囊鉴定的成分Table 1 Chemical components of Dengzhan Shengmai Capsules

续表1

续表1

3.1 黄酮类

黄酮类化合物广泛分布于自然界的植物中，是一类具有C6-C3-C6 基本骨架、以2-苯基色原酮为基本骨架衍生而来的化合物，其在质谱条件下的裂解通常围绕三碳链进行，具有相似的裂解规律。本实验共鉴定得到黄酮类化合物5 种，包括野黄芩苷（11）、木犀草素（16）、芹菜素（18）、山柰酚（19）及甲基麦冬黄酮B（26）。

以总离子流图中16 号峰为例，该化合物在正离子模式下获得分子离子峰287.05，经Xcalibur 软件拟合得到其对应分子式C15H10O6。通过分析其二级质谱谱图数据得到269.04、153.02、135.04、117.03、89.03 等多个拥有较好响应的碎片离子峰，分别对应[M＋H－H2O]+、[M＋H－C8H6O2]+、[M＋HC7H7O4]+、[M＋H－C7H7O4－H2O]+和[M＋HC7H7O4－H2O－CO]+。经与对照品保留时间及二级碎片离子信息进行对比，并结合对应对照品化合物结构式进行验证，最终确定16 号峰对应化合物为木犀草素。木犀草素裂解途径见图2。

图2 木犀草素裂解途径Fig.2 Fragmentation pathway of luteolin

3.2 木脂素类

药材五味子中富含木脂素类化合物，此类木脂素通常具有联苯环辛二烯结构，可在人体内发挥肝保护和抗氧化作用。本实验共鉴定出木脂素类化合物6 种，包括戈米辛D（22）、戈米辛J（23）、五味子酚（27）、五味子甲素（28）、五味子乙素（29）、五味子丙素（30）。

以总离子流图中28 号峰为例，该化合物在正离子模式下获得分子离子峰417.23，经Xcalibur 软件拟合得到其对应分子式C24H32O6。通过分析其二级质谱谱图数据得到402.20、386.21、347.15、316.13、301.11、285.11 等多个拥有较好响应的碎片离子峰，分别对应[M＋H－CH3]+、[M＋H－CH3O]+、[M＋H－C5H10]+、[M＋H－C5H10－CH3O]+、[M＋HC5H10－CH3O－CH3]+、[M＋H－C5H10－CH3OCH3O]+。经与对照品保留时间及二级碎片离子信息进行对比，并结合对应对照品化合物结构式进行验证，最终确定28 号峰对应化合物为五味子甲素。五味子甲素裂解途径见图3。

图3 五味子甲素裂解途径Fig.3 Fragmentation pathway of schizandrin A

3.3 酚酸类

酚酸类化合物是在一个苯环上有多个酚羟基取代的芳香羧酸类化合物，其具有很强的抗氧化、抗菌消炎和调血脂等药理作用。本实验共鉴定出酚酸类化合物6 种，包括龙胆酸（5）、原儿茶酸（6）、绿原酸（7）、咖啡酸（10）、阿魏酸（12）、水杨酸（15）。

以总离子流图中7 号峰为例，该化合物在负离子模式下获得分子离子峰353.09，经Xcalibur 软件拟合得到其对应分子式C16H18O9。通过分析其二级质谱谱图数据得到191.06、173.04、161.02、135.04、109.03 等多个拥有较好响应的碎片离子峰，分别对应[M－H－C9H6O3]-、[M－H－C9H6O3－H2O]-、[M－H－C7H12O6]-、[M－H－C7H10O6－CO]-、[MH－C7H10O6－CO－C2H2]-。经与对照品保留时间及二级碎片离子信息进行对比，并结合对应对照品化合物结构式进行验证，最终确定7 号峰对应化合物为绿原酸。绿原酸的裂解途径见图4。

图4 绿原酸裂解途径Fig.4 Fragmentation pathway of chlorogenic acid

3.4 皂苷类

皂苷类化合物是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，其主要分布于陆地高等植物中，具有广泛的药理活性[14]。本实验共鉴定出皂苷类化合物3 种，包括人参皂苷Ro（20）、人参皂苷Rg3（24）、人参皂苷Rg2（25）。

以总离子流图中24 号峰为例，该化合物在负离子模式下获得分子离子峰783.49，经Xcalibur 软件拟合得到其对应分子式C42H72O13。通过分析其二级质谱谱图数据得到621.44、459.39、375.29、161.04等多个拥有较好响应的碎片离子峰，分别对应[MH－C6H10O5]-、[M－H－C6H10O5－C6H10O5]-、[MH －C6H10O5－C6H10O5－C6H12]-、[M－H －C36H62O8]-。经与对照品保留时间及二级碎片离子信息进行对比，并结合对应对照品化合物结构式进行验证，最终确定24 号峰对应化合物为人参皂苷Rg3。人参皂苷Rg3的裂解途径见图5。

图5 人参皂苷Rg3 裂解途径Fig.5 Fragmentation pathway of ginsenoside Rg3

3.5 其他类

此外，本实验还从灯盏生脉胶囊中检测出葡萄糖醛酸、苹果酸、枸橼酸、琥珀酸、原儿茶醛、邻苯二甲酸、咖啡酸甲酯、咖啡酸、灯盏甲素、乙酸松油酯等，相关信息见表1。

3.6 网络药理学分析

3.6.1 灯盏生脉胶囊入血成分相关靶点 通过TCMSP 数据库、STITCH 数据库及SwissTarget Prediction 数据库对灯盏生脉胶囊所含成分及相关靶点进行预测，共得到16 个入血成分（琥珀酸、原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、木犀草素、芹菜素、山柰酚、戈米辛D、戈米辛J、人参皂苷Rg3、五味子酚、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素）及其相关255 个作用靶点，并依此构建了灯盏生脉胶囊的“成分-靶点”相互作用网络图（图6）。该网络包含271 个节点和500 条边，其中红色三角形代表16 个入血成分，绿色矩形代表255 个作用靶点。3.6.2 PPI 网络的构建

图6 灯盏生脉胶囊入血成分“成分-靶点”网络图Fig.6 “Compound-Target” network of ingredients of Dengzhan Shengmai Capsules in blood

（1）灯盏生脉胶囊“入血成分-靶点”PPI 网络：灯盏生脉胶囊入血成分靶点的蛋白互作网络中包含6787 个节点和164 190 条边，表明有6787 个相互作用蛋白及164 190 种相互作用关系。

（2）心绞痛相关“疾病-靶点”PPI 网络：利用OMIM 数据库、TDD 数据库、GeneCards 数据库、Disgenet 数据库对心绞痛相关疾病靶点进行检索，删除重复后共得到251 个作用靶点，并依此构建疾病靶点的蛋白互作网络。在心绞痛相关靶点蛋白互作网络中有6643 个相互作用蛋白和147 457 条相互作用关系。

3.6.3 核心靶点筛选 为了揭示灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的药理学机制，本研究将251 个疾病相关靶点与255 个成分相关作用靶点进行比对，共得到36个灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的潜在直接作用靶点，包括MAPT、ADRB1、PLAU、TNF、SELP、NOS3、SLC6A2、AR、AKT1、VEGFA、MMP9、IL10、IL6、TP53、MMP1、PPARG、HMOX1、ICAM1、IL2、IFNG、SLC2A4、CD40LG、MMP3、ESR1、SCN5A、F10、F7、SERPINE1、INS、NOS2、F2、SELE、VCAM1、NR3C2、HTR1B 和KCNH2。

此外，将灯盏生脉胶囊“入血成分-靶点”的PPI网络与心绞痛“疾病-靶点”的PPI 网络整合取交集，交集网络中共包含4456 个节点和120 926 条边；对交集网络进行拓扑结构分析，degree 值的中位数为33，故选择degree≥66（2 倍中位数值）的节点作为候选靶点，最终共筛选得到1089 个候选靶点；对候选靶点的相互作用网络进行提取分析，并以“BC、CC、EC、LAC、NC”分别大于其相应中位数为筛选条件，即BC≥439.461、CC≥0.51、EC≥0.019 3、LAC≥17.961、NC≥19.786，进一步筛选核心靶点，最终得到灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的核心靶点共368 个。

3.6.4 灯盏生脉胶囊治疗心绞痛预测靶点富集分析通过DAVID 对灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的368 个核心靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路分析。图7～9 显示了在生物过程、分子功能和细胞组件中排名前20 的条目。KEGG 富集分析得到灯盏生脉胶囊对心绞痛有显著影响的通路，表2 列出了P＜0.05 的30 条显著富集的通路，结果表明，灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的通路主要有MAPK 信号通路、p53 信号通路等[21-23]。

图7 灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的核心靶点的生物过程GO 分析Fig.7 Gene Ontology(GO)biological process analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

图8 灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的核心靶点的细胞组件GO 分析Fig.8 Gene Ontology(GO)cellular components analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

图9 灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的核心靶点的分子功能GO 分析Fig.9 Gene Ontology(GO)molecular function analysis on key targets of Dengzhan Shengmai Capsules against angina

表2 KEGG 富集分析Table 2 KEGG enrichment analysis

续表2

4 讨论

灯盏生脉胶囊对心绞痛疗效确切，但对其药效物质的相关研究匮乏，限制了对其在临床上精准用药的指导。本实验通过对灯盏生脉胶囊进行定性分析，共鉴定得到31 种化合物，包括黄酮类化合物5种、木脂素类化合物6 种、酚酸类化合物6 种、皂苷类化合物3 种和其他类10 种。通过网络药理学对其中16 个入血成分进行分析，共得到灯盏生脉胶囊治疗心绞痛的368 个核心靶点及MAPK 信号通路和p53 信号通路等主要通路，充分体现了中药多成分、多靶点、多通路协同作用发挥治疗效果的特点。本实验为探索灯盏生脉胶囊药效物质基础提供了新的思路，并为指导临床合理用药提供了科学的理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突