藏羊皮肤组织中低氧促有丝分裂因子的表达及分布研究

赵晓萌，买雨晨，周 宇，乔自林,2,3，杨 琨,2,3*

(1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730100；2. 西北民族大学生物医学研究中心甘肃省动物细胞技术创新中心；3.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室)

藏羊作为我国三大原始绵羊品系之一[1]，主要分布于青藏高原地区，其独特的地理因素使藏羊具有较高的通气量、血氧饱和度以及较低的肺动脉压和血红蛋白等特点[2]。且藏羊皮肤覆盖于整个机体体表，具有保护深部组织免受外界机械刺激、光化学辐射及抵御寒冷的作用，是研究高原生物低氧适应性的良好材料。

低氧促有丝分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor，HIMF)又称炎症区1(found in inflammatory zone 1，FIZZ1)或抵抗素样分子-α(resistin-like molecule α，RELMα)，是抵抗素样分子(resistin-like molecule/found in inflammatory zone,FIZZ/RELM)家族的一员[3]，该家族由FIZZ1/RELMα/HIMF，FIZZ2/RELMβ，FIZZ3/resistin和RELMγ组成[4]。其中低氧促有丝分裂因子始终以单体形式存在，其启动子区域受多个炎症相关转录因子调控，参与炎症反应调控、促进血管形成及收缩、促进细胞凋亡、介导骨髓细胞趋化等生物学功能[5-6]。

本研究以藏羊皮肤作为实验材料，应用苏木精-伊红染色法和免疫组织化学法的方法来探究藏羊皮肤组织中低氧促有丝分裂因子的表达及分布情况以及低氧促有丝分裂因子对高原动物低温耐氧的作用，旨在进一步为低氧促有丝分裂因子对高原动物适应低氧性的机制提供理论依据，具有高度的研究价值和创新意义。

1 材料与方法

1.1实验动物 采取位于甘肃省临夏回族自治州自然放养藏羊的健康皮肤组织。经宰割后迅速将藏羊皮肤的苏木精-伊红染色样本和免疫组化样本放于4%的多聚甲醛中固定。

1.2实验试剂 0.01 mol/L PBS磷酸盐缓冲液、0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液、兔多克隆抗体HIMF、免疫组化试剂盒(SP-0023)、DAB显色试剂盒(DA1015-3)，均来自于北京博奥森生物技术有限公司。

1.3HE染色及免疫组化SP染色 藏羊皮肤样本经乙醇浓度梯度脱水、石蜡包埋后，切成厚7 μm的石蜡切片，进行HE染色观察其组织结构的特点并应用免疫组织化学染色方法对切片进行检测。具体的HE染色及免疫组化SP染色方法依据说明书操作。

1.4图像采集及结果判定 藏羊皮肤切片于显微镜照相系统下采集图像。免疫组化染色结果依据着色程度深浅及着色面积判定。若低氧促有丝分裂因子在胞浆、胞核呈现深棕黄色或黄褐色则为强阳性表达，若棕黄色较浅则是弱阳性表达，处于强阳性与弱阳性之间是中性阳性表达，未出现棕黄色或与背景色相似的则为阴性表达。

2 结果与分析

2.1藏羊皮肤的组织学结构 青海藏羊的皮肤组织学结构与其它家畜的相似, 主要由表皮、真皮和皮下组织三部分组成[7]。其中初级毛囊较为粗长，从内向外依次包括毛髓质、毛皮质、内根鞘小皮、内根鞘、外根鞘、纤维鞘等结构，并伴有皮脂腺，其皮脂腺分泌部为几个实心的细胞团，细胞较大且胞质着色较浅，毛囊之间含有较多胶原纤维，次级毛囊较初级毛囊比细而小，且三毛群和一毛群数量较多(图1)。

图1 藏羊皮肤组织切片的HE染色法结果

2.2免疫组织化学表达 根据免疫组化表达阳性颜色的深浅可知，低氧促有丝分裂因子在藏羊皮肤的角质层呈棕黄色的强阳性表达，在初级毛囊和次级毛囊的外根鞘、内鞘小皮中有大量的阳性着色，为集中的阳性表达，在毛根呈现少量阳性表达，在藏羊的表皮和真皮中均未见表达(图2)。

图2 藏羊皮肤HIMF蛋白免疫组织化学检测结果

3 讨论

藏羊皮肤覆盖于整个机体体表，在高原的低温缺氧环境下最先进行代偿，作为氧感受器参与全身低氧反应调节[8]。

HIMF作为一种低氧时小鼠肺组织分泌的分泌物为促成有丝分裂因子，在老鼠表皮角质形成细胞和皮脂细胞中表达[9]，本研究则发现低氧促有丝分裂因子在藏羊皮肤的角质层、初级毛囊和次级毛囊的外根鞘、内鞘小皮以及毛根中存在表达，二者之间相互关联。据研究表明，抵抗素样分子在人类皮肤的免疫防御中具有重要作用，且这项研究揭示了抵抗素样分子基因多态性与在皮肤(如寻常痤疮和化脓性汗腺炎)中的作用[10]。然而若缺乏低氧促有丝分裂因子，皮肤的微生物群则会发生改变，有学者就利用了CRISPR/Cas9介导的基因，靶向敲除小鼠的Retnla基因位点，验证了Retnla小鼠皮肤中不存在促有丝分裂因子的结论[9]。

低氧促有丝分裂因子具有促进细胞增殖、迁移、分化、趋化、收缩血管及促进血管新生等功能[11-12]，兼有炎症因子和生长因子的共同特性且受多个炎症相关转录因子调控。如低氧促有丝分裂因子能够作为小鼠伤口中交替激活的巨噬细胞介导Plod2[12]，在IL4Rα介导的巨噬细胞赖氨酸羟化酶(lysyl hydroxylase2, LH2)的产生过程中发挥作用，使敲除IL4Rα基因的组织产生不良预后的作用[13]，IL-4和IFN-γ共同调节巨噬细胞FIZZ1的表达[14]，以及可以诱导HIF-1α在肺部的表达、诱导新生血管形成，通过依赖HIF-1α的信号通路上调VEGF及下调VEGFR2的表达等[15]。

本试验得出低氧促有丝分裂因子在藏羊皮肤的角质层呈现高度表达的状态，在初级毛囊和次级毛囊的外根鞘、内鞘小皮中呈中度表达、在毛根呈现少量表达的结果，表明二者存在一定关系，低温缺氧能刺激低氧促有丝分裂因子在皮肤中的表达，对藏羊的生长发育起调节作用，但其具体的表达机制有待进一步研究。

4 结语

苏木精-伊红染色结果表明藏羊皮肤组织由表皮、真皮、皮下组织三部分构成。通过免疫组化技术发现低氧促有丝分裂因子在藏羊的表皮、真皮中均未表达，在藏羊皮肤的角质层呈棕黄色的强阳性表达，在初级毛囊和次级毛囊的外根鞘、内鞘小皮中呈集中的阳性表达，在毛根呈现少量阳性表达。根据低氧促有丝分裂因子促进藏羊皮肤组织表达的结果得出在低温缺氧的条件下藏羊皮肤能够表达低氧促有丝分裂因子的特性，进而推测低氧促有丝分裂因子对高原动物低温缺氧适应性起着重要调节作用。