大肠杆菌耐药菌的体外诱导及主动外排基因acrA表达量的变化

付赛赛，秦广利，夏威风，刘培培

(1.商丘职业技术学院，河南 商丘 476000； 2.商丘市动物卫生监督所)

随着抗菌药在兽医临床长期应用，临床分离菌对各种抗生素类药物的耐药率都在逐年升高[1]。目前研究表明，大肠埃希菌的主动外排作用是产生多重耐药的重要原因[2-4]，也是当前国内外研究的热点之一。主动外排系指大肠杆菌细胞内膜存在的能量依赖性蛋白质外输泵，通过主动外排作用，可将药物从菌体内排出，使到达作用靶位点的药量减少，不足以发挥杀菌或抑菌作用[5]。大肠杆菌是发现外输泵最多的一种细菌，在埃希氏大肠杆菌上发现了30多种外输泵，但一般认为AcrAB-TolC是最主要的外输泵[6,15]。本试验主要研究大肠杆菌的诱导不同代数耐药性与主动外排基因acrA表达量的关系，是外输泵介导的大肠杆菌耐药性研究中具有重要意义的步骤。

1 材料与方法

1.1试验菌株 试验菌株编号分别为：1、11、88、017、035、040、045、048、94、T7等10株。其各株对环丙沙星的最低抑菌浓度值(MIC)见表1。

表1 菌株环丙沙星的MIC值(μg/mL)

1.2试验方法

1.2.1耐药菌的诱导 使用环丙沙星对以上10株“耐药菌”进行诱导培养。将1/2 MIC的环丙沙星溶液作为初始诱导浓度。37℃恒温培养18～24 h，此即为1代，连续共计传30代，每隔5代测定MIC，并调整LB肉汤中的药物浓度，使之始终保持1/2 MIC。并将诱导的菌液划线于麦康凯培养基，观察菌落形态及是否污染有杂菌。若在传代过程中菌株生长不良，则使用上代菌株在无药物状态下使细菌生长，但不计代数，然后加入1/2 MIC的药物继续传代。挑取每隔5代的菌株，并在每个原有菌株编号下标5、10、15、20、25、30表示诱导的代数，共得到诱导培养的菌株60株，用于下一步诱导菌株外排表达量的测定。

1.2.2总RNA抽提 利用Trizol法。

1.2.3浓度检测 取2 μL储存液加入另一个EP管中，再加入98 μL无RNase水，离心混匀，以无RNase水作空白对照，核酸定量检测仪测定RNA的吸收值，根据OD260值计算RNA的浓度，以OD260/OD280的比值判断其纯度。

1.2.5cDNA的PCR扩增 以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，按照比例配制反应体系，反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s、62 ℃退火30 s、72 ℃ 60 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后，取5 μL PCR扩增产物，1.0%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.3PCR产物的纯化与回收

1.3.1持家基因的扩增 将稀释好的胶回收PCR产物作为模板进行扩增，反应体系为20 μL：SYBR real-time PCR premature 10 μL；FP、RP各0.4 μL，不同浓度稀释的模板2 μL，超纯水7.2 μL。

1.3.3实时定量PCR检测mRNA水平 利用本研究所建立的实时定量RT-PCR的方法对样品中持家基因gapA和大肠杆菌主动外排基因acrA进行定量检测，得到各个检测样品的Ct值。利用持家基因做校正，对大肠杆菌主动外排基因mRNA相对表达水平进行分析。

1.4相对表达水平计算 采用2-△△Ct法计算各基因在不耐药程度菌株中的相对表达水平，具体方法如下：测定各个检测样品的Ct值，每个样品重复 2次，并由熔解曲线判定PCR反应的特异性，然后由测得的各菌株的主动外排基因acrA基因的Ct值，减去相同菌株的持家基因gapA的Ct值，即得校正值，记做△Ct，即△Ct目的基因=Ct目的基因-Ct持家基因，然后用临床菌株各个基因的△Ct值，减去大肠杆菌标准菌株ATCC25922对应的△Ct值，即得△△Ct，即△△Ct=△Ct临床株-△Ct标准菌株，各目的基因mRNA的相对表达量以2-△△Ct表示。

2 结果与分析

2.1最低抑菌浓度 各个诱导大肠杆菌的MIC值如表2所示。

从表2可以看出，不同菌株的大肠杆菌随着在含有1/2 MIC的培养基中培养，各个大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)均有所增加。菌株94、035、040、045、048培养到30代时， 最低抑菌浓度(MIC)变为原来的2倍；菌株88、017的MIC都变为原来的4倍，但是菌株88的MIC值经历先变小后变大的过程；而菌株1的耐药性相对比较稳定，其最低抑菌浓度一直是256 μg/mL。菌株11在用含有1/2 MIC环丙沙星的培养液培养时一直未长出菌体，1/4 MIC、1/8 MIC、2 μg/mL、1 μg/mL也未长出菌体，可能是该大肠杆菌发生变异，导致对环丙沙星的耐药性丧失。

表2 环丙沙星对诱导菌株MIC值的测定结果(μg/mL)

2.2相对表达水平 采用2-△△Ct法计算不同耐药菌株主动外排基因 acrA的相对表达量，结果见表3。

表3 不同耐药程度临床菌株主动外排基因acrA的相对表达量

在1/2 MIC培养基中培养菌株1，菌株1的MIC值始终没有发生变化，但是acrA的表达量却增加很大；菌株017的acrA表达量呈波浪式变化，总体趋势是增加的；菌株035与94在耐药性培养中虽然所测MIC有所增加，但其主动外排基因acrA的表达量却呈递减的趋势；菌株040的acrA表达量先下降然后再急速上升；菌株T7主动外排基因acrA的表达量先减少，再增加，后又减少，变化幅度相当大；菌株048的acrA的表达量先减少后增加，菌株045的acrA基因表达量与菌株017的acrA基因表达量有点相似，也呈波浪式变化。从整体结果来看，除了菌株035和菌株94外，其它几株菌株的acrA表达量均增加，说明大肠杆菌的耐药性与主动外排基因acrA的表达量有相关性 。

3 讨论与分析

普遍的观点认为抗菌药物的使用是病原菌产生耐药性的关键所在。由于抗菌药长期持续的不当使用，给细菌的生存环境造成了选择性压力，这种环境压力因素可以通过多种机制导致病原菌对抗菌药物产生耐药性[7]。药物外输泵是一类位于细胞膜上的具有特殊结构的膜转运蛋白质，其作用机理为当细胞内的药物浓度聚集达到一定数值时，药物外输泵系统相关mRNA的表达增加，结果使细胞膜上外输泵的数量增加，使细胞内的药物被泵出，从而使细菌耐药[10]。本试验依据大肠杆菌的耐药机理，将大肠杆菌在人工选择性压力环境下培养，以期大肠杆菌的MIC值发生变化。从实验结果来看，除了菌株1的MIC值没有发生变化，菌株11 对环丙沙星的耐药性丧失，其它几株大肠杆菌的MIC值变化2-8倍不等。MIC变化不一样，可能不仅与药物外输泵有关，还与其它耐药机制有关。

现已公认AcrAB-TolC是大肠埃希氏菌最主要的外输泵，AcrAB-TolC包括药物质子转运子AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC[8,11,15]。其中acrA基因的表达可造成大肠杆菌对多种药物的耐药性，因此，主动外排基因acrA表达量对大肠杆菌的耐药性有着至关重要的作用。普遍认为大肠杆菌对环丙沙星的耐药性与主动外排基因acrA的表达量呈正相关。但是此次的实验结果却不尽相同，菌株1的MIC值未发生变化，但acrA表达量增加了许多；菌株017和045均呈现波浪式变化，菌株035和94的MIC虽然都升高了，但acrA的表达量却减少；其它几株菌株的acrA表达量均增加。说明大肠杆菌acrA基因的表达量与MIC值有一定的相关性，但是也不一定呈正相关。对此种现象产生的原因，推测可能是由于不止一种外输泵的激活，或是可能还有其他的耐药机制的作用。因为细菌的耐药有着多种而复杂的机制[9,13]，或者外输泵外排能力显著提高。