蔡 婷,明平红
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)是动脉中膜的主要组成成分,其由中膜层迁移至内膜下层间隙并异常增殖或凋亡是动脉粥样硬化、高血压、血管狭窄等多种心血管疾病的共同发病基础[1]。三七是临床常用的传统中药,具有强壮补虚、消肿镇痛、活血化瘀等功效。研究表明,三七在预防和治疗心脑血管系统、中枢神经系统、抗氧化、抗自由基损伤等方面具有较好活性[2-5]。三七皂苷R1(notoginsenoside R1,NGR1)是三七提取物中有效活性成分之一,然而NGR1是否具有预防和治疗动脉粥样硬化作用并不清楚。本研究拟采用血小板衍生生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMC增殖,再加入NGR1进行干预,研究NGR1对增殖型VSMC的影响。
1.1 主要试剂 NGR1由上海源叶生物科技有限公司生产,货号:B21099,CAS号:80418-24-2,配制成1 mg/mL作为母液浓度储存备用。细胞计数试剂盒(CCK-8)购自大连美仑生物技术有限公司,货号:MA0218。VSMC由华中科技大学附属同济医院提供。胰蛋白酶(trypsin)、胎牛血清(FBS)、PDGF-BB购自Gibco公司。
1.2 主要仪器 二氧化碳(CO2)培养箱(品牌:Thermo Scientific,型号:BB150);多功能酶标仪(品牌:BioTek,型号:Epoch2);荧光倒置显微镜(品牌:OLYMPUS,型号:BX51-P)
1.3 细胞培养 VSMC在DMEM完全培养基(含10%FBS、1%青霉素和链霉素)中静置于37 ℃的CO2培养箱中进行培养。当细胞生长融合约至90%后,用胰蛋白酶消化传代,取3~5次传代对数生长期细胞进行实验。
1.4 CCK-8检测细胞增殖实验 收集对数生长期的VSMC,用胰蛋白酶消化,调节细胞悬液浓度为1×105/mL,接种100 μL细胞悬液到96孔板中,置37 ℃、5%的CO2培养箱中培养。设置空白组(A组)、PDGF-BB诱导组(B组)、PDGF-BB+20 μmol/L NGR1组(C组)、PDGF-BB+40 μmol/L NGR1组(D组)、PDGF-BB+80 μmol/L NGR1组(E组)、PDGF-BB+160 μmol/L NGR1组(F组)。待细胞贴壁融合约50%后,在20 ng/mL的PDGF-BB刺激下[6]加入不同剂量的NGR1(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)继续处理24 h和48 h,再向每孔加入10 μL的CCK-8继续培养1 h,加入10 μL的HCL终止,在酶标仪上(450 nm)测各孔的OD值,每组设6个复孔。
1.5 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染细胞核实验 取对数期生长的VSMC细胞,接种于6孔板,设置空白组(A组)、PDGF-BB诱导组(B组)、PDGF-BB+20 μmol/L NGR1组(C组)、PDGF-BB+40 μmol/L NGR1组(D组)、PDGF-BB+80 μmol/L NGR1组(E组)、PDGF-BB+160 μmol/L NGR1组(F组)。先用PDGF-BB诱导VSMC增殖,再使用不同浓度NGR1(20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L、160 μmol/L)处理48 h,移除培养基,1×磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞,4%多聚甲醛固定细胞15 min,移除多聚甲醛并洗涤,用1% Triton-X-100破膜10 min,1×PBS漂洗之后,用100 mg/L DAPI染色10 min,PBS漂洗之后,于荧光显微镜下观察细胞核形态变化。
2.1 NGR1对增殖型VSMC增殖的影响 B组细胞增殖率明显高于A组(P<0.05),说明PDGF-BB可诱导VSMC增殖;C组细胞增殖率与B组比较差异无统计学意义(P>0.05),但D组细胞增殖率明显高于B组(P<0.05),说明NGR1浓度增加至40 μmol/L时,NGR1可促进VSMC增殖;E组(80 μmol/L)和F组(160 μmol/L)细胞增殖率均明显低于B组(P<0.05),随着浓度增大和时间延长,细胞增殖率降低。说明较低浓度的(40 μmol/L)NGR1能够促进VSMC增殖,而较高浓度的(80 μmol/L和160 μmol/L)NGR1能够抑制VSMC的增殖,且呈时间和剂量依赖性。详见表1、图1。
表1 NGR1对增殖型VSMC增殖的影响 (±s) 单位:%
图1 NGR1对增殖型VSMC增殖的影响
2.2 NGR1对增殖型VSMC凋亡的影响 DAPI染色结果显示,NGR1在低浓度(20 μmol/L和40 μmol/L)时细胞核形态未发生明显改变,但随着NGR1浓度增加至高浓度(80 μmol/L和160 μmol/L),细胞核形态呈圆形且出现大小不一的高致密片段,甚至出现凋亡小体(160 μmol/L),说明高浓度NGR1能诱导PDGF-BB诱导的增殖型VSMC凋亡且呈剂量依赖性。详见图2。
图2 NGR1诱导增殖型VSMC凋亡情况
VSMC是动脉中膜的主要组成成分,参与了动脉粥样硬化斑块形成的所有阶段[1,7]。根据损伤反应和易损斑块假说,收缩型VSMC在炎性因子的刺激下经过表型活化转化为增殖型细胞,然后从中膜层向内膜层大量迁移与增殖,并摄取脂质成为肌源性泡沫细胞,当脂质过分充满细胞时,导致细胞发生凋亡。未清除的凋亡细胞随后发生继发性坏死,进一步释放炎性物质,在PDGF以及转换生长因子-β(TGF-β)等刺激下,胶原纤维和弹力纤维组成纤维帽包绕脂池形成典型的粥样硬化斑块,最终使血管内膜增厚,导致管腔狭窄[8]。因此,有效抑制血管损伤后血管平滑肌细胞的过度增殖和迁移,可能成为抗血管再狭窄和抗动脉粥样硬化形成的治疗策略。
NGR1是三七总皂苷中有效活性成分之一,三七总皂苷对增殖型VSMC具有抑制作用[9-11],为了研究NGR1对增殖型VSMC的影响,本研究用PDGF-BB诱导VSMC转化成增殖型细胞,与空白组比较,细胞数量明显增加,证实PDGF-BB能成功诱导VSMC增殖[12-13]。成功诱导后再加入不同剂量的NGR1处理24 h和48 h,发现NGR1在低浓度(40 μmol/L)时可促进VSMC增殖,但在高浓度(80 μmol/L和160 μmol/L)时能抑制VSMC增殖,且呈剂量依赖性。研究表明,大多数药物一般通过诱导细胞凋亡来抑制细胞增殖[14-17]。本研究显示,NGR1在低浓度(20 μmol/L和40 μmol/L)处理增殖型VSMC 48 h后,细胞核形态并未发生明显改变,但随着NGR1浓度增加至高浓度时(80 μmol/L和160 μmol/L),细胞核逐渐变成圆形且出现大小不一的高致密片段(80 μmol/L),当NGR1浓度达160 μmol/L时出现典型的凋亡小体,说明高浓度NGR1能诱导增殖型VSMC发生凋亡。
PDGF-BB可诱导VSMC转化成增殖型细胞。低浓度的NGR1可促进VSMC增殖,高浓度的NGR1能抑制VSMC增殖,且呈剂量依赖性,并能进一步诱导VSMC发生凋亡。因此,本研究提示合理浓度范围的NGR1可能对预防和治疗动脉粥样硬化类疾病具有重要作用。