基于网络药理学的丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的物质基础及作用机制研究

曹新福，李 享，刘红旭，周明学，2

快速性心律失常是一种常见的心律失常，包括频发房性期前收缩、频发室性期前收缩、房性心动过速、室性心动过速、室上性心动过速、心房扑动、心房颤动等。中国大陆室性心律失常的年猝死总人数达54.5万人[1-2]。目前西医治疗快速性心律失常的方法主要包括以钠通道阻滞剂、β受体阻滞剂、钾通道阻滞剂、非二氢吡啶类钙拮抗剂等为主的药物治疗，以及以射频消融术和埋藏式心律转复除颤器植入术等为主的非药物治疗，抗心律失常药物不良反应较大，且多有致心律失常的副作用，在一定程度上限制了其使用，器械治疗有创且价格昂贵，病人不易接受。快速性心律失常属中医学“心悸”“怔忡”范畴，国家级名老中医魏执真教授提出了快速性心律失常关键病机为“瘀热”，治疗上首创凉血清热法，临证时重用丹皮、赤芍、黄连，在快速性心律失常的治疗上效果显著[3-5]，同时有多项研究表明丹皮-赤芍-黄连具有明确的抗实验性快速性心律失常作用[6-7]，但其发挥作用的分子机制尚不清楚。本研究尝试从网络药理学角度探寻凉血清热药组丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的物质基础和可能作用机制。

1 资料与方法

1.1 药物成分及靶点的筛选 应用中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)，网址：http://tcmspw.com/，分别以丹皮、赤芍、黄连为关键词检索出所有化合物成分，以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为筛选条件，筛选化合物成分，另外结合文献对于未能入选，但是文献报道有生物活性和药理作用的也纳入候选化学成分，并依托TCMSP中的TargetsInfomation模块筛选得到相应成分的作用靶点。最后，应用STRING 10.5数据库(http://string-db.org/)将检索得到的所有靶点校正为其官方名称(official symbol)。

1.2 疾病相关靶点的收集及药物-疾病共同靶点筛选 以“Tachyarrhythmia”为关键词通过GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)，检索与快速性心律失常相关的靶点，并将结果以EXCEL格式导出。将疾病靶点与药物成分靶点输入Venny 2.1在线软件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行交集，得到药物-疾病之间的共同靶点，绘制韦恩图。

1.3 蛋白相互作用网络构建 将筛选得到的疾病-药物共同靶点导入STRING 10.5数据库，构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型，将蛋白种类设置为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值设为>0.40，其他参数保持默认设置，获得PPI网络。

1.4 药物-成分-靶点-疾病全局网络构建 采用Cytoscape(Version 3.7.1)软件构建药物-成分-靶点-疾病网络，并将该网络与得到的PPI网络经Cytoscape的Merge功能合成全局性药物-成分-靶点-疾病网络。通过Cytoscape的附加功能CytoNCA计算网络中节点的度中心性(degree centrality，DC)、中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)，这4个参数是网络药理学研究中评价网络节点重要性的核心参数，值越大，说明节点越接近网络的中心，越有可能是关键靶点。采用4个核心参数分析并筛选丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的核心靶点。

1.5 基因本体(GO)富集分析和京都基因及基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 应用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对药物-疾病共同靶点进行GO富集分析以及KEGG通路富集分析，并采用Omicshare软件绘制KEGG富集分析条状图。

2 结 果

2.1 丹皮-赤芍-黄连化学成分及靶点筛选 通过检索TCMSP数据库，以OB≥30%和DL≥0.18为条件，纳入化学成分54个，有研究表明丹皮中丹皮酚(paeonol)含量较高且有明确的药理作用[8]，故也纳入候选成分，共得到化学成分55个，其中丹皮12个、赤芍29个、黄连14个，候选化学成分基本信息见表1。通过TCMSP数据库检索候选化学成分的靶点，共检索到55个化学成分对应的533个作用靶点，其中丹皮对应的靶点有267个，赤芍对应的靶点有158个，黄连对应的点有161个，去重后共保留204个药物靶点。应用STRING 10.5数据库通过输入靶点名称并限定物种为人，将检索得到的所有靶点校正为其官方名称(official symbol)。

表1 候选化学成分基本信息

2.2 疾病相关靶点的收集及药物-疾病共同靶点筛选 以“Tachyarrhythmia”为关键词，检索Gencards数据库得到与疾病快速性心律失常相关的有治疗作用的靶点共222个。将疾病靶点与药物靶点输入Venny 2.1软件绘制韦恩图(见图1)，并进行交集，得到药物-疾病之间的共同靶点共16个，16个靶点信息详见表2。

表2 药物-疾病共同靶点

图1 药物-疾病靶点韦恩图

2.3 PPI网络构建 将16个共同靶点导入STRING 10.5数据库中，获得PPI网络图，详见图2。图中节点表示每个靶点，节点之间的直线代表靶点间有相互作用关系，每种颜色的线条分别代表不同关系，线条越多代表作用关系越强。

图2 药物-疾病共同靶点PPI网络

2.4 药物-成分-靶点-疾病全局网络构建 采用Cytoscape 3.7.1软件构建药物-成分-靶点-疾病网络，可得到网络A，采用Cytoscape 3.7.1软件对PPI网络进行转化，可得到网络图B，利用Cytoscape软件中的Merge功能，将网络A和网络B进行合并，得到药物-成分-靶点-疾病全局网络C，详见图3。网络中节点代表药物、成分、靶点、疾病，边代表药物-成分-靶点-疾病之间的相互作用。采用CytoNCA计算网络节点的 DC、BC、CC和EC值，靶点网络拓扑学参数见表3，得到网络中靶点DC中位数为13.5，度值大于中位数的靶点有NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6、ADRA1B、GJA1、TGFB1，说明这些靶点可能是丹皮-赤芍-黄连干预快速性心律失常的核心靶点。由图3可知，与16个共同靶点有相互作用关系的药物成分共有14个，这些成分可能为丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的关键成分，详见表4。其中丹皮中有3个，分别为quercetin、kaempferol、paeonol；赤芍中有3个，分别为beta-sitosterol、paeoniflorin、Stigmasterol；黄连中有8个，分别为(R)-Canadine、coptisine、Berlambine、berberine、epiberberine、Worenine、palmatine、berberrubine。

表3 全局网络靶点拓扑学参数

表4 与共同靶点有相互作用关系的药物成分

图3 药物-成分-靶点-疾病全局网络

2.5 GO功能富集分析 利用DAVID数据库对16个药物-疾病共同靶点进行GO富集分析，根据P<0.05，共收集到48个生物过程(BP)、10个细胞组分(CC)、8个分子功能(MF)，详见表5～表7。生物过程主要涉及心室肌细胞膜复极的调节、腺苷酸环化酶激活、肾上腺素能受体信号通路、钠离子输运的调节、细胞信号转导、肽基丝氨酸磷酸化的正调控、MAPK级联的正调控、蛋白激酶B信号传导的正调控、去甲肾上腺素对血管舒张的调节作用、心室肌细胞膜去极化的调节、基因表达的负调控、心房肌细胞膜去极化的调控、心房心肌细胞动作电位等。细胞组分主要涉及质膜、突触后膜、轴突、细胞外基质、轴突终末、侧质膜等。分子功能主要涉及支架蛋白结合、蛋白质结合、酶结合、去甲肾上腺素结合、肾上腺素结合、乙酰胆碱结合、蛋白质均聚活性、离子通道活性等。

表5 GO富集-生物过程

表6 GO富集-细胞组分

表7 GO富集-分子功能

2.6 KEGG通路富集分析 利用DAVID数据库对16个药物-疾病共同靶点进行KEGG通路富集分析，根据P<0.05，共收集到13条信号通路，详见表8。以P-adjust值进行排序，并绘制柱状图，详见图4。其中与快速性心律失常相关度较高的通路有3条，分别为cGMP-PKG信号通路(NOS3/ADRB2/ADRB1/ADRA1B/OPRD1)、心肌细胞肾上腺素能信号转导通路(SCN5A/ADRB2/ADRB1/ADRA1B)、钙信号通路(NOS3/ADRB2/ADRB1/CHRM3/ADRA1B)。

表8 KEGG通路富集分析

图4 KEGG通路富集分析

3 讨 论

中医理论建立在系统医学方法论基础上， 单一的成分或作用靶点研究难以充分揭示中药复方的作用机制，而基于生物信息学基础，运用网络药理学挖掘中药复方治疗疾病的物质基础和分子机制，超越了单靶点思想的束缚，从多靶点的研究策略出发，通过构建网络阐述复方多成分、多靶点、多作用机制的特点，从整体角度评价复方作用机制，其理念与中医学的整体观基本一致[9]。本研究基于网络药理学对丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的物质成分、潜在靶点及可能信号通路进行了初步探寻。药物-成分-靶点-疾病全局网络分析结果显示，丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的关键成分共有14个，黄连中有8个，丹皮、赤芍各有3个。根据现有文献报道，其中具有较明确抗快速性心律失常作用的成分有4个，分别为丹皮酚(丹皮)、槲皮素(丹皮)、芍药苷(赤芍)、小檗碱(黄连)。丹皮酚可阻断SD大鼠心肌细胞的钙通道，减少钙离子内流，降低心肌兴奋性，进而抑制乌头碱诱发的大鼠心律失常[10]；槲皮素能延长氯化钙诱发大鼠心律失常出现的时间，缩短心律失常持续时间，减少心律失常发生率及死亡率[11]；芍药苷可能通过阻断L型钙电流(ICa，L)，内向整流钾电流和钠电流，降低心室复极离散度，防止折返的形成，发挥抗心律失常作用[12]；欧阳松等[13]研究表明，小檗碱可能通过抑制延迟整流钾电流、乙酰胆碱调节的钾电流，延长心房肌场电位时程(fAPD)，加快兴奋传导速度(ECV)，延长心房肌细胞的动作电位时程(APD)及有效不应期(ERP)，从而发挥抗心房颤动作用。

药物-成分-靶点-疾病全局网络拓扑分析结果显示，NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6、ADRA1B、GJA1、TGFB1等为丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的潜在靶点。根据现有研究报道，提示与快速性心律失常关系较密切的靶点有5个，分别为NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6。NOS3信号传导通过调节L型Ca2+通道，降低钙电流(ICa)抑制β肾上腺素能受体反应，缩短APD，从而起到抗心律失常作用[14]。KCNH2编码的电压门控钾通道的α亚基，该通道介导心脏中延迟整流钾电流的快速激活成分(IKr)，是心肌细胞动作电位3期快速复极的主要电流，KCNH2基因突变与长QT依赖的扭转型室性心动过速(TdP)和心室纤颤(VF)相关[15]。SCN5A基因编码NAv1.5通道蛋白，该蛋白作为心脏电压门控钠离子通道的成孔α亚基，对于心房和心室动作电位的启动和传播至关重要[16]，SCN5A功能获得性突变不仅降低电流密度，也呈现出持续的晩钠电流，持续的晩钠电流扰乱心房肌细胞复极化，延长动作电位，从而诱发包括心房颤动及室性心律失常等[17]。ADRB2基因编码β2肾上腺素能受体，该受体在蒲肯野纤维和窦房结有较高的分布，主要作用是通过影响钾、钙离子通道电流参与心律调节[18]。炎症在心房颤动的发生和进展过程中扮演了重要角色，炎性因子IL6参与了心房颤动的发生和发展过程，炎性因子的水平变化与心房颤动预后相关[19]。

GO功能富集显示，丹皮-赤芍-黄连对快速性心律失常作用靶点包含48个生物过程、10个细胞组分、8个分子功能。主要体现在心肌细胞膜去极、复极的调节，细胞信号转导，离子通道活性，受体结合等方面。KEGG通路富集分析结果中与快速性心律失常相关的通路有3条，分别为cGMP-PKG信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导通路、钙信号通路等。其中，cGMP-PKG信号通路中cGMP是第二使者，介导一氧化氮(NO)的作用，其主要效应子之一是cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)，其催化包括CaV1.2等离子通道在内的多种蛋白质磷酸化，导致蛋白活性或功能发生变化，而离子通道的活性和功能变化与心律失常的发生密切相关[20]。心肌细胞肾上腺素能信号转导通路主要涉及α和β肾上腺素能受体，通过α和β受体影响ICa，L、IKr、延迟整流钾电流的慢成分(IKs)、内向整流钾电流(IK1)等电流，影响心室肌复极化过程，从而影响心律失常的发生与发展，其中α受体主要的调节途径包括通过G蛋白偶联磷脂酶C(PLC)调节细胞膜磷酯(PIP2)代谢导致的抑制作用，影响最明显的是对KCNQ1、hERG和Kir2通道，分别导致IKs、IKr、IK1电流抑制；β受体在心室肌上主要为β1亚型占绝对优势，并由cAMP-PKA磷酸化途径介导了ICa，L和IKs电流增强效应[21]。钙信号通路受β肾上腺素及α1肾上腺素的调节，β肾上腺素能受体激活后能通过激活电压门控型钙通道和受体门控型钙通道的开放，促进胞外Ca2+内流，而α1肾上腺素能受体可以激活PLC介导的细胞内信号转导，水解磷酸化二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，生成二酯酰甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)，IP3与内质网上的IP3配体门钙通道结合，开启钙通道，使胞内Ca2+浓度升高，激活包括钙调蛋白(CaM)在内的各类依赖钙离子的蛋白，调节肌浆网对Ca2+释放，进而调节细胞内的Ca2+浓度，当CaM表达异常时易出现心肌细胞内钙超载，引起瞬时内向电流导致延迟后除极，是自律性心律失常的重要发病机制[22-23]。

本研究提示槲皮素、丹皮酚、芍药苷、小檗碱等可能为丹皮、赤芍、黄连发挥作用的关键成分，其通过作用于NOS3、KCNH2、SCN5A、ADRB2、IL6等靶点，影响多种离子通道活性和心肌细胞膜的去极、复极以及cGMP-PKG信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导通路和钙信号通路，从而发挥抗心律失常作用。本研究初步揭示了丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的可能成分、潜在靶点以及信号通路，为后续进一步开展凉血清热药组丹皮-赤芍-黄连治疗快速性心律失常的物质基础及作用机制相关研究提供了新的思路。