金黄色葡萄球菌毒力因子与儿童金黄色葡萄球菌软组织感染、肺炎的相关性*

麻明彪,黄海林,许 彬,李小娟,李 珏,世淑兰,王海平,杜廷义△

1.云南省昆明市儿童医院检验科,云南昆明 650228；2.云南省儿童重大疾病研究重点实验室,云南昆明 650228

儿童金黄色葡萄球菌(SA)软组织感染与肺炎是临床儿科的常见病和多发病。儿童SA软组织感染常表现为皮下脓肿、脐炎、关节炎、蜂窝织炎或烫伤样皮肤综合征等，而SA肺炎可表现为持续性或反复发热、气促、咳嗽，甚至感染性休克，病情比一般细菌性肺炎重，进展快，早期诊断较难，易延误治疗，目前仍是儿童和婴幼儿期病死率较高的一种疾病[1-2]。SA感染与其产生、分泌的外毒素密切相关，常见的外毒素主要包括杀白细胞毒素(PVL)、中毒性休克综合征毒素1(TSST-1)、溶血素(HL)、肠毒素(SEs)和表皮剥脱毒素(ETs)等。以往儿童SA软组织感染及肺炎的研究主要集中在探讨患儿的临床特征、毒素分子的作用机制和SA的耐药性，而对SA毒素编码基因在儿童软组织感染及肺炎中的分布差异，以及病原体毒素基因的携带与疾病临床表现之间的相关性研究甚少[3-4]。因此，本研究主要探讨了儿童SA软组织感染及肺炎中SA PVL基因(pvl)、中毒性休克综合征毒素1基因(tst-1)和α溶血素基因(hl-α)的分布情况，以及毒素基因的携带与患儿临床表现的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 以2018年10月至2019年3月昆明市儿童医院确诊为SA软组织感染和SA肺炎的住院患儿为研究对象。研究对象纳入标准：(1)年龄≤18岁，性别不限；(2)临床诊断和病原学检测确诊为软组织SA感染或SA肺炎；(3)患儿临床资料完整。

1.2方法

1.2.1临床资料收集 收集纳入研究患儿的临床资料，主要包括性别、年龄、感染部位、临床诊断、体温、心率、血压、呼吸频率以及意识状态。肺炎严重程度根据简化英国胸科协会改良肺炎评分(CRB-65)进行评估、分组，0～2分为轻症肺炎，≥3分为重症肺炎。

1.2.2菌株收集及鉴定 采集软组织感染分泌物、深部痰液、肺泡灌洗液或血液分离培养得到的SA菌株，剔除同一病例的重复菌株。所有菌株经菌落形态观察、革兰染色镜检以及法国生物梅里埃公司Vitek-2 Compact全自动微生物分析仪进行鉴定。

1.2.3菌株pvl、tst-1和hl-α的检测 使用细菌基因组DNA提取试剂盒(TaKaRa公司)提取SA基因组DNA。根据GeneBank中公布的pvl、tst-1和hl-α的DNA序列，利用Oligo7.0软件进行引物设计，由昆明硕擎生物技术有限公司进行引物合成，各基因引物序列见表1。使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa公司)通过PCR分别检测pvl、tst-1和hl-α，PCR扩增反应体系总体积为25 μL，其中TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，10 μmol/L的正向/反向引物各1 μL，细菌DNA模板2 μL，无RNA酶的双蒸水8.5 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共30个循环；72 ℃ 8 min。扩增结束后将产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。电泳条件：电压110 V，电流240 mA，时间38 min。

表1 pvl、tst-1和hl-α的引物序列

2 结 果

2.1患儿一般情况 纳入研究的75例患儿中，34例为SA软组织感染，其中男11例、女23例，年龄11 d至9岁，中位年龄1.8岁，临床表现为皮下脓肿(16例)、皮肤表皮感染(7例)、关节术后感染(7例)、烫伤样皮肤综合征(2例)、蜂窝织炎(1例)和脐炎(1例)。41例确诊为SA肺炎，用于检测标本：34例为痰液，4例为肺泡灌洗液，3例为血液。根据CRB-65，30例为轻症肺炎，其中男17例、女13例，年龄7 d至4岁、中位年龄1个月；11例为重症肺炎，其中男6例、女5例，年龄8 d至3岁、中位年龄1个月。

2.2pvl、tst-1和hl-α的检测及检出率 PCR检测75株SA的pvl、tst-1和hl-α，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析显示，pvl阳性(pvl+)SA在433 bp处有条带，tst-1阳性(tst-1+)SA在578 bp处有条带；hl-α阳性(hl-α+)SA在210 bp处有条带。pvl在软组织感染组中的检出率最高[52.94%(18/34)]，其次为重症肺炎组[45.45%(5/11)]，轻症肺炎组检出率最低[20%(6/30)]，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；tst-1在重症肺炎组中的检出率最高[72.73%(8/11)]，其次为软组织感染组[29.41%(10/34)]，在轻症肺炎组中未检测到，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；hl-α在3个组别中均有检出，但检出率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 pvl、tst-1和hl-α在不同组别中的检出情况[n(%)]

2.3pvl+tst-1阴性(tst-1-)与pvl阴性(pvl-)tst-1-SA感染患儿生命体征参数的比较 pvl+tst-1-与pvl-tst-1-SA软组织感染患儿比较，体温、呼吸频率、心率、血压(包括舒张压、收缩压)差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。pvl+tst-1-与pvl-tst-1-SA肺炎患儿比较，体温、呼吸频率和心率更高，而舒张压更低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表3 pvl+tst-1-与pvl-tst-1-SA软组织感染患儿生命体征参数的比较

表4 pvl+tst-1-与pvl-tst-1-SA肺炎患儿生命体征参数的比较

2.4pvl-tst-1+与pvl-tst-1-SA感染患儿生命体征参数的比较 pvl-tst-1+与pvl-tst-1-SA软组织感染患儿体温、呼吸频率、心率、血压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表5。pvl-tst-1+与pvl-tst-1-SA肺炎患儿比较，体温和呼吸频率更高，差异有统计学意义(P<0.05)，心率和血压差异无统计学意义(P>0.05)，见表6。

表5 pvl-tst-1+与pvl-tst-1-SA软组织感染患儿生命体征参数的比较或M(Q)]

表6 pvl-tst-1+与pvl-tst-1-SA肺炎患儿生命体征参数的比较

3 讨 论

SA是临床上常见的条件致病菌之一，也是我国儿童和新生儿患者中检出率最高的革兰阳性菌，可导致人体局部或全身性的感染，如毛囊炎、皮下脓肿、肺炎以及中毒性休克综合征等。其感染严重也可引起败血症而导致死亡[5]。SA引起的感染性疾病是其产生、分泌各种毒素、侵袭性酶与机体免疫相互作用的结果，且在不同感染类型中产生、分泌的毒素也有所差异[6]。本研究探讨了儿童SA软组织感染及肺炎中SA毒素编码基因pvl、tst-1和hl-α的检出情况。结果显示：pvl在儿童SA软组织感染组中检出率最高，在SA轻、重症肺炎组中也有检出；tst-1在儿童SA重症肺炎组中检出率极高，其次为软组织感染组，而在轻症肺炎组中未检测到；hl-α在SA中有很高携带率，但各组的检出率无明显差异。

对于SA软组织感染，CRIBIER等[7]最早报道PVL可能与皮肤软组织感染相关，而后LINA等[8]也证实了pvl在疖、蜂窝织炎、皮肤脓肿等软组织感染中有较高的检出率。一项回顾性研究更进一步明确了pvl与皮肤软组织感染相关[9]。因此，结合本研究的结果，表明儿童SA软组织感染主要由pvl+SA引起。此外，根据患儿的相关临床特征进行分析：无论SA是否携带pvl或tst-1，SA软组织感染患儿的相关生命指征，包括体温、呼吸频率、心率和血压均无明显差异，分析其原因可能是因患儿感染病灶局限，未累及机体重要脏器，或引起系统性感染，从而不常伴有发烧、呼吸急促、心率加快和低血压等全身性反应的症状。但在SA肺炎患儿中，由pvl+SA引起肺炎患儿的体温、呼吸频率和心率均高于pvl-SA引起的肺炎，血压也低于pvl-SA引起的肺炎。相关研究也表明，PVL在坏死性肺炎发生过程中起重要作用，且pvl表达水平与肺炎感染严重程度呈正相关[9-10]。pvl+SA肺炎病理表现为肺组织表面覆盖大量SA，气管和支气管黏膜出血，肺实质内肺空泡形成、出血以及肺泡间隔坏死等，临床症状常伴有呼吸急促、心率加快、低血压等病情危重征兆，具有很高的病死率[11-14]。因此，pvl的携带可增强SA的致病力，使其引起肺炎的病情更严重。

在11例重症肺炎患儿中，有8例患儿感染的SA携带有tst-1，检出率高达72.73%，而在轻症肺炎患儿中未检测到tst-1。由此提示，tst-1可能与儿童重症肺炎的发生密切相关。结合肺炎患儿临床特征分析，在8例tst-1+重症肺炎患儿中，多数患儿伴有发烧、呼吸急促、意识障碍，并且1例出现呼吸衰竭、1例出现肺出血等病情危重表现。相关研究表明，tst-1编码合成的TSST-1属于致热原性超抗原家族，是引起中毒性休克综合征最主要的致病因子[15]。TSST-1具有很强的超抗原活性，可直接与抗原提呈细胞表面的主要组织相容复合物Ⅱ类分子(MHCⅡ)的抗原结合槽外侧结合，形成MHCⅡ-TSST-1复合物，然后直接激活T淋巴细胞抗原受体的特异性β链V区，促进T细胞活化、增殖并释放大量炎性细胞因子引起强烈的免疫应答，最终导致机体炎症失控和多器官损害[16-17]。此外，TSST-1还可直接损伤Kupffer细胞(又称库普弗细胞)，抑制内毒素脱颗粒反应，导致内毒素在体内大量蓄积而引起内毒素血症,发生内毒素休克[18]。虽然tst-1+SA肺炎患儿的心率和血压与tst-1-SA肺炎患儿差异无统计学意义，但根据具体数据来看，大部分tst-1+SA肺炎患儿的心率还是快于tst-1-SA肺炎患儿，血压也比其低，其原因可能是本研究中检出tst-1+SA肺炎患儿例数较少，从而导致统计结果无明显差异。因此，tst-1的检测对儿童重症SA肺炎的临床诊断和病情预判有潜在价值，此外，对tst-1+SA肺炎患儿，临床应提高警惕，并及时采取合理治疗措施避免重症肺炎的发生。

综上所述，pvl主要见于儿童SA软组织感染，且在儿童SA肺炎中可导致病情加重；tst-1与儿童SA重症肺炎的发生密切相关，tst-1检测对儿童SA重症肺炎的诊断和病情预判有潜在价值，对tst-1+SA肺炎患儿应提高警惕，并及时采取合理治疗措施避免重症发生。hl-α在儿童SA软组织感染及肺炎中均有较高检出率，无明显特异性。