衍生化及非衍生化串联质谱法在遗传代谢疾病筛查及诊断中的应用及比较*

丁 丽，张 瑞

空军军医大学第一附属医院检验科，陕西西安 710032

在过去，遗传代谢病的诊断和治疗绝大多数依赖于医师的临床经验和一些非特异的生化指标,临床医生往往难以作出具体病因诊断[1]。随着临床诊断学的不断发展，尤其是高效液相色谱-串联质谱技术应用于临床检验的快速发展，这种局面已经改观[2]。该技术可在几分钟内同时进行数十种代谢物的分析,对包括氨基酸、有机酸、脂肪酸氧化代谢紊乱在内的多种遗传代谢性疾病进行筛查[3-4]。目前高效液相色谱-串联质谱用于遗传代谢病筛查的方法有衍生化和非衍生化串联质谱法两种[5]，本文比较了衍生化和非衍生化串联质谱法的差异。

1 资料与方法

1.1一般资料 将本院2016年5月至2017年12月采集的健康新生儿和儿童干血斑标本共1 060例(主要来自西部地区,儿童：男230例、女225例，共455例；新生儿：男309例、女296例,共605例)用于参考值范围考察。从中随机选取310例标本用于方法一致性考察。另外选取同期于本院确诊的7例苯丙酮尿症患儿干血斑标本用于考察衍生化和非衍生化串联质谱法的临床应用情况。

1.2仪器与试剂 仪器： API3200串联质谱仪购于美国AB生物应用系统公司,高效液相色谱仪购于美国安捷仑公司 (Agilent 1200型)，96孔板加热吹干装置购于杭州奥盛公司(MD200型)，加热振荡仪购于Thermo Scientific公司(Iems Incubator/Shaker HT220-240V型)。试剂：甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等试剂购于Thermo Scientific公司，均为色谱级。将正丁醇和乙酰氯按体积比9∶1配制成3 mol/L的盐酸正丁醇溶液作为衍生化试剂备用,96孔聚丙烯板购于博奥公司。实验中所用氮气的纯度为99.9%以上。9种氨基酸内标物和9种酰基肉碱内标物均用甲醇溶解并稀释配制成萃取液,保存于4 ℃条件下,于1个月内用完。

1.3方法

1.3.1干血斑标本的制备与保存 儿童干血斑标本：于上午7-9时采集空腹儿童末梢血滴于专用采血滤纸上，形成几个均匀血斑,完全渗透，待自然晾干后，封于塑料袋内，-20 ℃冰箱保存待检；新生儿干血斑标本：新生儿出生3 d后，哺乳多次，采足后跟血于空白采血滤纸上，完全渗透，待自然晾干后，封于塑料袋内，-20 ℃冰箱保存待检。

1.3.211种氨基酸和22种酰基肉碱检测的参考值范围确定 通过检测健康新生儿和儿童干血斑标本中的11种氨基酸：丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、瓜氨酸(Cit)、甘氨酸(Gly)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、酪氨酸(Try)、缬氨酸(Val)，以及22种酰基肉碱：游离肉碱(C0)、乙酰肉碱(C2)、丙酰肉碱(C3)、丁酰肉碱(C4)、异戊酰肉碱(C5)、己酰肉碱(C6)、辛酰肉碱(C8)、癸酰肉碱(C10)、 十二酰肉碱(C12)、十四酰肉碱(C14)、十六酰肉碱(C16)、十八酰肉碱(C18)、异戊烯酰肉碱(C5:1)、辛烯酰肉碱(C8:1)、癸烯酰肉碱(C10:1)、癸二烯酰肉碱(C10:2)、十二烯酰肉碱(C12:1)、十四烯酰肉碱(C14:1)、十四碳二烯酰肉碱(C14:2)、十六烯酰肉碱(C16:1)、十八碳二烯酰肉碱(C18:2)、十八烯酰肉碱(C18:1)，从而确定本实验室检测的参考值范围上下限。

1.3.3衍生化串联质谱法 (1)样品处理：用打孔器在干血片上制直径3 mm 的圆形血片(4个作为质控品,1个作为空白对照),置于96孔板中,每孔加入萃取液100 μL,室温密封振荡15 min以萃取血片中的待测物质,然后转移萃取液至另一个96孔聚丙烯板,40 ℃加热并用氮气吹干,再加入60 mL衍生化试剂,Teflon 膜覆盖,置于65 ℃恒温箱内反应20 min,随后40 ℃加热并用氮气吹干,再加入80%乙腈水溶液(乙腈-水体积比为80∶20)100 μL 溶解,铝膜覆盖,串联质谱仪检测。(2)仪器设置：乙腈作为流动相,设置液相色谱的流速为300 μL/min,进样量为20 μL，质谱测定中性氨基酸采用中性丢失扫描方式,中性丢失片断质荷比(m/z)为102,扫描范围为140～280; Gly、Orn、Arg、Cit采用多反应检测,每个样品检测只需要2 min。(3)定量分析:采用美国AB生物应用系统公司的ChemoView 2.0.2 软件,由经过衍生化的待测物及其同位素内标物的离子峰强度,计算出所测标本中待测物浓度。

1．4非衍生化串联质谱法 (1)样品处理：用打孔器在干血片上制直径3 mm 的圆形血片，置于96孔板中,每孔内加入含同位素内标物的萃取液100 μL，Teflon膜密封，45 ℃密封振荡45 min，振荡频率650 r/min，萃取血片中的氨基酸和酰基肉碱，转移至另一个96孔聚丙烯板，铝膜覆盖，即可上样检测。(2)仪器设置:乙腈作为流动相,设置液相色谱的流速为300 μL/min,进样量为20 μL，质谱测定中性氨基酸采用中性丢失扫描方式,中性丢失片断质荷比(m/z)为102,扫描范围为140～280;Gly、Orn、Arg、Cit采用多反应检测,每个样品检测只需要2 min。(3)定量分析：定量分析采用美国AB生物应用系统公司的ChemoView 2.0.2 软件,由待测物及其同位素内标的离子峰强度,计算出所测标本中待测物质的浓度。

1.5参考值范围的确定 计算各指标的P2.5～P97.5，初步建立本实验室衍生化串联质谱法和非衍生化串联质谱法检测氨基酸和肉碱的参考值范围。

1.6精密度的评估 分别采用衍生化和非衍生化串联质谱法检测低、中、高3种浓度的氨基酸和酰基肉碱样品，计算批内变异系数(CV批内)和批间变异系数(CV批间)，评估两种方法的精密度。

1.7方法一致性考察 采用Bland-Altman法评估衍生化和非衍生化串联质谱法检测结果的一致性,P<0.05为差异有统计学意义，即方法不一致。

1.8临床应用 同时运用衍生化串联质谱法和非衍生化串联质谱法检测已经确诊的苯丙酮尿症患儿的氨基酸和酰基肉碱水平来考察两种方法在临床应用中的可行性。

2 结 果

2.1两种方法的参考值范围 两种方法的参考值范围见表1。

2.2两种方法的精密度评估 非衍生化串联质谱法的CV批内为2.06%～7.39%，CV批间为3.64%～10.97%；衍生化串联质谱法的CV批内为4.14%～10.95%，CV批间为6.14%～12.91%。

2.3方法的一致性考察 以Phe检测结果为代表，见图1。3.37%的点位于95%一致性界限(LoA)之外；在LoA范围以内，两种测量方法差值的平均值为-0.1，接近0，说明两种方法的测量结果较为接近；P=0.27>0.05，两种方法检测的结果差异无统计学意义，具有较好的一致性。

图1 衍生化与非衍生化串联质谱法的Bland-Altman分析图

2．4临床应用 运用衍生化串联质谱法和非衍生化串联质谱法同时检测7例已经确诊的苯丙酮尿症患儿体内的氨基酸和酰基肉碱水平，7例患儿的Phe水平均高于参考值，而且无论是衍生化还是非衍生化串联质谱法检测7例患儿的Phe/Tyr比值均大于3，即阳性检出率均为100%。

3 讨 论

虽然单一病种的遗传代谢病发病率低，但因其种类繁多，所以总体发病率较高[6-7]。在我国，该疾病的构成中氨基酸代谢异常占了大部分，其次为有机酸代谢异常，脂肪酸氧化代谢障碍最少[8-9]。串联质谱法用于新生儿遗传代谢疾病的筛查具有简便、快速、精准、高效等优点[10-11]，不仅扩展了筛查的疾病谱，也是新生儿疾病诊断中最重要的进展[12-15]。采用衍生化与非衍生化串联质谱法进行干血斑的氨基酸和酰基肉碱分析均可在2 min内完成检测,两种方法的参考值范围虽略有不同，但均能够达到较高的精密度,其中非衍生化法简便易行，标本处理步骤少时间短，精密度更高，但是衍生化法的检出限更低，更加灵敏，所以衍生化法更适用于低端质谱。本研究采用Bland-Altman法评估了衍生化和非衍生化两种方法的一致性。以 Phe为代表，结果显示仅有3.37%的点位于95% LoA之外，96.63%的结果均在LoA范围以内，两种测量方法差值的均线值接近0值，两种方法的检测结果较为接近，两种方法具有较好的一致性(P>0.05)。两种检测方法对于7例苯丙酮尿症患儿标本的阳性检出率均为100%。

综上所述，在遗传代谢病筛查的过程中，衍生化串联质谱法和非衍生化串联质谱法均可满足临床对遗传代谢疾病筛查及诊断的需要。