新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑制备及储存影响因素研究*

朱文娟 魏友华 王 蕊 魏 莉 王志俊 山东省枣庄市妇幼保健院医学遗传与产前筛查科 277100

新生儿遗传代谢病是指由于基因突变引起酶缺陷、细胞膜功能异常或受体缺陷，从而导致机体生化代谢紊乱，造成中间或旁路代谢产物蓄积或终末代谢产物缺乏而引起一系列临床症状的一组疾病[1-2]。早期筛查、诊断、治疗新生儿遗传代谢疾病能够有效降低新生儿出生缺陷，是我国出生缺陷三级防控体系的重要组成部分，是提高儿童健康水平和生活质量的重要技术保证[3]。以串联质谱技术为代表新一代疾病筛查体系，应用于氨基酸、有机酸、脂肪酸和糖代谢异常以及溶酶体贮积症等新生儿遗传代谢病筛查，实现了一种检测方法检测多种疾病的技术转变[4]。然而干血斑中的这些生物标记物极易受血斑制备及血斑储存条件的影响，保证血斑制备和储存条件稳定性，对于分析干血斑中氨基酸和肉碱浓度尤其重要。但是关于不同制备温度、紫外线污染及不同储存温度对新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑中氨基酸和肉碱含量影响国内鲜有系统研究与报道，故为进一步规范各实验室室间质量控制，降低筛查假阳性及假阴性出现的可能，提高串联质谱筛查质量，更好地促进新生儿疾病筛查业务规范开展，有必要对影响干血斑中氨基酸及肉碱稳定性因素进行全面、系统探究。因此，本研究主要探讨在串联质谱技术支持下，研究不同制备温度、紫外线污染及不同储存温度对新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑中氨基酸和肉碱含量影响，以便选择最佳储存条件提高串联质谱筛查质量，更好地促进新生儿疾病筛查业务的规范开展。

1 资料与方法

1.1 标本 参照新生儿疾病筛查采血技术规范要求，为避免人群个体因素对检测结果产生的影响，标本制作的血液来源为知情同意的健康志愿者。采血部位为肘前静脉(空腹)，直接将注射器中的全血以定量的形式滴加在滤纸上，利用采血卡制备直径8mm标准血斑。

1.2 仪器和试剂 采用美国Waters公司生产的TQ Detector串联质谱仪分析以及美国PerkinElmer公司生产的配套非衍生多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒。

1.3 方法 为研究不同制备温度对血斑中氨基酸及肉碱含量影响将制备的部分标准新鲜血斑分为4℃、25℃及37℃三组进行制备。血斑制备后，每组从干血斑边缘取3个复孔进行试验，每个实验组进行3次重复实验，以试剂盒自带质控品为对照组，通过Waters-TQD串联质谱仪利用非衍生化法进行干血斑内氨基酸及肉碱含量分析。为研究紫外射线污染对血斑中氨基酸及肉碱含量影响将制备的部分标准新鲜血斑分为25℃制备组与25℃制备过程中紫外灯照射组两组。血斑制备后，每组从干血斑边缘取3个复孔进行试验，每个实验组进行3次重复实验，以试剂盒自带质控品为对照组，通过Waters-TQD串联质谱仪利用非衍生化法进行干血斑内氨基酸及肉碱含量分析。为研究储存温度对干血斑中氨基酸和肉碱含量变化将25℃制备的部分标准血斑根据储存温度以及储存时间分为三组，分别为4℃制备组，-20℃制备组，-80℃制备组。每组检测时间分别为保存0d、7d、3个月。检测时，每组从干血斑边缘取3个复孔进行试验，每个实验组进行3次重复实验，以试剂盒自带质控品为对照组，通过Waters-TQD串联质谱仪利用非衍生化法进行干血斑内氨基酸及肉碱含量分析。

2 结果

2.1 不同制备温度对干血斑中氨基酸及肉碱含量影响 在4℃、25℃及37℃三种温度条件下对新鲜血斑标本进行制备时，血斑中肉碱含量稳定，未产生显著差异变化(数据未显示)；而血斑中部分氨基酸含量则产生显著性变化。如表1所示：37℃制备组中ARG含量显著高于4℃制备组与25℃制备组(P<0.05)；但是4℃制备组与25℃制备组ARG含量比较无统计学差异；而37℃制备组中ORN含量显著低于4℃制备组(P<0.05),但25℃制备组与37℃制备组及4℃制备组分别比较时，各组间无统计学差异。

表1 不同制备温度对新鲜血斑中氨基酸含量影响

2.2 紫外线污染对干血斑中氨基酸及肉碱含量的影响 为研究血斑制备过程中受到紫外线污染时对血斑中氨基酸及肉碱含量的影响，笔者研究了血斑在25℃制备、25℃制备时受到紫外线照射污染两种情况下干血斑中氨基酸及肉碱含量变化。如表2、3所示，25℃制备时受到紫外线污染组干血斑中ARG含量显著高于25℃制备时未受紫外线污染组(P<0.05)，两组中其他氨基酸含量及肉碱含量无统计学差异。

表2 紫外射线污染对血斑中肉碱含量影响

表3 紫外射线污染对血斑中氨基酸含量影响

2.3 储存温度对干血斑中氨基酸和肉碱含量影响 如表4所示，4℃、-20℃及-80℃对制备的干血斑密封保存7d，干血斑中氨基酸及肉碱指标含量未有显著性变化；随着保存时间到90d时，与-20℃及-80℃保存条件相比，4℃密封储存干血斑时，GLY、MET、ORN以及肉碱中C2、C3均有显著性降低，但是C0表现出显著性升高，存在统计学差异。但是-20℃与-80℃对密封保存的干血斑中氨基酸(除ORN外)及肉碱含量(除C16外)变化无显著性统计学差异。

表4 不同储存时间对干血斑中氨基酸和肉碱含量影响

3 讨论

新生儿疾病筛查在我国出生缺陷三级防控体系中起着重要作用。串联质谱技术作为新一代疾病筛查体系代表有效推动了新生儿疾病筛查的自动化和筛查效率，使得筛查的疾病种类也越来越多，新生儿疾病筛查和诊断工作也面临越来越多的问题亟待解决。其中分析前质量问题(主要涉及标本采集时间、采集方式、运输方式以及储存方式等)涉及环节多，人为影响因素大，不易标准量化而越来越成为影响新生儿疾病筛查质量的主要影响因素[5]。

电喷雾离子质谱检测经同位素标记的氨基酸是全世界范围内普遍采用的新生儿筛查法，卫生部临床检验中心串联质谱检测氨基酸和肉碱的室间质量评价结果表明串联质谱检测氨基酸和酰基肉碱的质量水平差异较大[6]。

早期国内李启亮等[7]研究表明：血斑制备后储存时间对多数氨基酸含量没有明显影响，但是GLY随标本储存时间延长而含量下降，4℃储存3个月时与新鲜干血斑标本比较存在显著统计学差异。本研究结果也证实，与新鲜干血斑相比，4℃保存3个月后，血斑中除GLY出现显著性下降外，ARG、MET、VAL也表现出同样的变化趋势，且存在统计学差异。同时国外研究表明：在长期储存的干血斑中，游离肉碱含量在前5年的时间里每年增加7.6%，而在随后的时间里每年降低1.4%，氨基酸含量则每年均存在一定程度的损失，但不同氨基酸每年下降程度不同，表明氨基酸及酰基肉碱在干血斑中的含量呈现出不稳定性[8]。另外，Golbahar J等研究了干血滴滤纸片法采集样品短期稳定性，考察了新生儿先天代谢性疾病血样在极端条件下(温度和湿度)，7种氨基酸和10种酰基肉碱的含量变化，发现温度或湿度过高均大大降低检测的灵敏度，血样最好是低温干燥保存，可以显著降低筛查过程中假阳性的出现[4]。

另一方面，本研究发现：在4℃、25℃及37℃三种温度条件下对新鲜血斑标本进行制备时，血斑中肉碱含量稳定；与4℃相比，37℃制备血斑时，血斑中ARG含量上升45%，而ORN含量则下降8.8%，两个指标具有统计学差异。与郭元芳等人[9]对干血斑中ARG浓度与环境温度和湿度变化呈现反比例关系的结论不一致，表明环境湿度可能对干血斑中氨基酸浓度的影响更大。与25℃制备干血斑中氨基酸及肉碱含量相比，在25℃制备过程中受到紫外线污染时，血斑中肉碱含量未有明显变化，但血斑中ARG含量上升23%，ORN含量下降11%，两个指标差异具有统计学意义。随着储存时间延长，干血斑中各氨基酸指标含量存在一定程度降低，尤其以ARG、VAL含量降低幅度明显，这可能与干血斑中水解酶浓度增加有关；干血斑肉碱指标含量保持稳定；但是在4℃条件下储存标本时，血斑中C0含量在3个月后上升约40%，这与之前国外研究结果相符合，国外研究中同样指出C0这种含量趋势变化与酰基肉碱酯化体系的水解有关[4，10]。同时，本研究发现，4℃储存干血斑时，随着时间推移，MET含量与C2含量在3个月后急剧降低为原来的50%，这种MET与C2的含量下降在-20℃及-80℃储存条件下并未出现，该种情形的出现有待于进一步的研究发现。

本研究结果表明：新生儿遗传代谢性疾病筛查干血斑制备过程中温度变化对于干血斑中ARG与ORN含量影响显著，同时干血斑制备过程中受到紫外线污染时导致血斑中ARG含量的增加，但是制备温度及紫外线污染对血斑中肉碱含量影响未有统计学差异。因此新生儿疾病筛查干血斑在制备时应尽量保持室内温度恒定(室温25℃)，避免我国北方因冬夏季节差异影响干血斑中检测物质含量的变化，同时避免受到紫外射线污染以降低对血斑中氨基酸含量的影响。本实验结果表明，-20℃条件对制备的干血斑密封保存能很好保证干血斑中氨基酸及肉碱含量的稳定性，目前实验室从血斑制备至实验室完成检测时间跨度为1周是合适的时间范围，也能满足日常实验检测质控需求。