分散固相萃取-GC-MS法测定海产品中9种有机锡化合物

王 姮，胡红美，郭远明，金衍健，杨承虎

(1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山316022;2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021)

有机锡化合物(organotin compounds，OTs)是一类锡与碳元素结合的金属有机化合物，常在工业、农业等领域被用作杀虫剂、除草剂和船舶的防污涂料。它们具有高毒性，其中三丁基锡(tributyhin，TBT)和三苯基锡(triphyltin，TPhT)在水中达到ng/L水平就能引发海产腹足类生物的雌性不育甚至种群灭绝［1］。同时，OTs易富集于海洋生物的内脏、性腺和鳃中，具有一定的生物富集性［2］，研究表明，有机锡在鱼类、贝类等生物体内生物浓缩系数(BCF)最高达8700000，并具有生物放大作用，一旦被人类食用，最终将威胁人类健康和生命。最近Chen等［3］研究中发现南方沿海地带海产品中TPhT含量在246～1484 ng/g之间，说明我国南方沿海地区的海产品仍然存在严重的有机锡污染。在全国范围内，中国每年生产约200 t TPhT［4］。因此加强针对有机锡化合物的探究对保护环境和保障食品安全都很重要。

通常采用气相色谱－质谱法(GC－MS)［5－9］、气相色谱－电感耦合等离子质谱法［10－11］和气相色谱－脉冲火焰光度法［12－15］等测定海产品中的有机锡化合物。此外还有高效液相色谱法与电感耦合等离子质谱法联用［16－17］、高效液相色谱－原子荧光光谱联用法［18］、高效液相色谱－串联质谱法［19－20］、石墨炉原子吸收光谱法［21］等检测方法。且采用气相色谱法时还必须结合衍生技术，将有机锡化合物转化为易挥发的物质使其在分析过程中气化但不分解。而相比气相色谱法，液相法虽然无需衍生，但与其联用的高灵敏检测器较少［22］。由于GC－MS既有气相色谱高效、快速的分离性能，又有质谱准确定性的优势，目前在海产品中有机锡化合物检测中将具有更广泛的应用前景。

同时，不管选择何种检测方法，还需结合超声波萃取、顶空单滴液相微萃取、固相微萃取、微波辅助提取、索氏提取等萃取技术和凝胶渗透色谱、固相萃取、层析柱净化等净化技术进行样品前处理。但采用凝胶渗透色谱净化时洗脱溶剂用量较大，设备运行成本高［23］;虽然层析柱的使用投入不大，但必须手动装填，要用到大量的吸附剂而且重现性也很不理想;目前商品化的固相萃取小柱广泛应用于不同样品的净化过程，但还要进行萃取柱活化、上样、淋洗、洗脱等过程，较为费时间和人力，不太适用于处理大量的样品。Anastassiades等［24］在2003年提出了分散固相萃取技术，这是一种快速、高效的净化技术，为实现水产品有机锡快速前处理提供了新思路。该净化技术只需要通过振荡和过膜等方式，直接将吸附剂添加至提取液中进行净化，还可以有效地除去水产品基质中的干扰物，实现了样品快速、简便的净化处理［25］，但目前该法在水产品中OTs前处理方面鲜有报道。因此，针对有机锡检测存在前处理过程复杂等问题，本文开发了超声波萃取、分散固相萃取净化，GC－MS法同时检测海产品中9种有机锡化合物的新方法，并对前处理过程进行了优化，以满足市场对灵敏度、精密度和准确度的需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

N－丙基乙二胺(Primary secondary amine，PSA，粒径40～63μm)，C18(粒径40～63μm)、硅胶吸附剂(Si，粒径40～46μm)、弗罗里硅土(Florisil，粒径60～100目)、中性氧化铝(Alumina－N，粒径100～300目)、石墨化炭黑(Graphitized carbon black，GCB，粒径120～400目)、四乙基硼化钠(NaBEt4)上海安谱科学仪器有限公司;9种OTs标准品:具体内容详见表1，德国Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、醋酸、四氢呋喃、正己烷(色谱纯)，铜粉(分析纯)国药集团化学试剂有限公司;环庚三烯酚酮(分析纯)上海紫一试剂厂;实验用水 均为实验室自制二次蒸馏水;样品(含鱼类、贝类、虾类、蟹类)均购自舟山市海产批发市场，共计12个样品，用洁净的食品级聚乙烯塑料袋裹住样品后，立即用专用便携冷藏装置送至实验室。

7890B/5977A气相色谱－质谱仪 美国Agilent公司;VS22－500A超声波萃取仪 无锡沃信仪器制造有限公司;Vortex4型涡旋振荡器 德国IKA公司;SIGMA 8KS高速离心机 德国Sigma公司;ChristALPHA 1－2 LD plus冷冻干燥机 美国Christ公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液的配制 9种OTs标准储备溶液(1000μg/L):加入甲醇溶液进行配制，逐次稀释后用甲醇定容，配出1000μg/L的混标溶液，在4℃的温度条件下储放。

1.2.2 样品制样和保存 制样时，将鱼类样品去除其外皮和鳞片，沿着其脊背取下肌肉部分;将虾类和蟹类样品去除其头部、外壳和附肢部分，取其肌肉部分;将贝类样品去除壳部，只取其可食用部分。样品切为长宽高均不大于0.5 cm的大小，用样品组织研磨机匀质后在－55℃冷凝器温度下冷冻干燥12 h(同时测定其含水率，便于最后实际样品测定浓度也可以按湿重计)，取出后置于－18℃温度条件下冷冻保存，待测。

1.2.3 样品前处理 精确称量1.2.2中1.00 g待测的样品于50 mL离心管中，添加5 mL含0.03%环庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)，经涡旋振荡2 min后，以300 W功率在35℃的条件下连续超声提取15 min，添加1～3 g铜粉进行脱硫，3000 r/min转速下离心5 min，取其上清液，再向样品中添加5 mL含0.03%环庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)，重复如上操作后，将提取液收集于15 mL离心管后置于－80℃，冷冻脱脂2 h后，6000 r/min转速下离心5 min，取出上清液到另一支15 mL离心管，再添入100 mg PSA固相吸附剂，涡旋振荡1 min后，转速6000 r/min下离心2 min，再取上清液到另一支50 mL离心管，添入40 mL醋酸－醋酸钠缓冲溶液(1 mol/L，pH4.5～5)、1 g氯化钠、5 mL正己烷后，涡旋振荡后添入200μL含四乙基硼化钠(10%)的四氢呋喃，振荡15 min后，6000 r/min的转速下离心2 min，取出上层的正己烷相，并在正己烷相中添加200 mg用于脱水的无水硫酸钠、100 mg GCB固相吸附剂，涡旋1 min，取上清液通过0.22μm的滤膜，最后在温度38℃的水浴下，吹氮气蒸发到干，用正己烷进行溶解，最后定容到200μL，用GC－MS进行分析。

表1 9种OTs保留时间、定量离子、定性离子Table 1 Retention times，quantitative ions，and qualifier ions of 9 OTs

1.2.4 色谱条件 HP－35MS毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);载气为高纯氦气(纯度99.999%)，流量1.0 mL/min;进样口温度260℃。进样方式:不分流进样，进样1μL;传输线温度260℃。柱升温程序:初始温度60℃，保持1.0 min，以20℃/min升温至220℃，保持10 min，最后以15℃/min升温至280℃，保持5.0 min，总运行时间28 min。

1.2.5 质谱条件 离子源配置为电子轰击(EI)，温度为230℃，电离能量为70 eV;溶剂延迟时间为3 min;四极杆温度为150℃，选择离子SIM监测;离子定量定性信息详见表1。

2 结果与分析

2.1 萃取方式的选择

由于索氏提取、振荡提取等常用方法在萃取时耗费时间和人力，同时会用到许多对环境和人体有害的试剂。快速溶剂萃取和微波萃取法所需仪器设备价格较高。超声波萃取法不仅能够萃取出结构较为稳定的OTs，同时还具有高效、仪器设备低廉、试验步骤简捷等长处，目前已有一些研究运用该法来萃取海产品中的有机锡［15，18，26］。综上，本次研究决定对海产品的OTs采取超声波萃取法。有机锡检测中常用的萃取剂有正己烷［27］、甲醇［28］、盐酸－甲醇(v/v，1∶1)［10］、醋酸－甲醇(v/v，1∶1)［16］、二氯甲烷［29］、正己烷－环庚三烯酚酮［30］等。在萃取剂中添加二乙基二硫基代氨基甲酸钠(NaDDTC)［31］、环庚三烯酚酮［25］等常见的螯合剂，可以通过提升OTs在有机相中的溶解能力来提高超声波萃取的效率。采用含环庚三烯酚酮的有机溶剂萃取OTs时可提高目标化合物的溶解能力［32］，提高其萃取效率，且环庚三烯酚酮在0.01～0.5 g/100 mL的范围内萃取效率并无明显差异。本方法最终选择含0.03%环庚三烯酚酮的醋酸∶甲醇(1∶9，v/v)溶液作为萃取剂。

2.2 净化方式的选择

色素和油脂是影响检测海产品有机锡化合物的主要杂质。采取凝胶渗透色谱和固相萃取小柱/层析柱联合净化是已有报道研究常用的净化方式。本研究首次采用冷冻脱脂和衍生前后各进行一次分散固相萃取进行净化，净化效果较为显著。其中冷冻脱脂技术相对简捷，无需使用额外试剂及凝胶渗透色谱等大型仪器设备，且能除去相当一部分脂肪，为后续进行两次分散固相萃取净化奠定基础。使用PSA固相吸附剂能去除干扰OTs检测结果的脂肪酸、碳水化合物、糖类、酚类和部分极性色素的不利因子［33］，所以在衍生和反萃取之前，首先选择PSA固相吸附剂进行分散固相萃取净化。而衍生后进行第二次分散固相萃取净化时，比较了C18、PSA、GCB等固相吸附剂的分散固相萃取净化效果(图1)，结果显示运用GCB进行吸附后提取液基本呈无色透明，9种OTs的回收率较高(75.4%～118.2%)。因此本研究采用GCB作为第二次分散固相萃取净化的吸附剂。

图1 不同吸附剂对萃取效果的影响Fig.1 The effect of different adsorbents on extraction efficiency

2.3 衍生条件的选择

使用GC法检测OTs时通常要进行衍生。有机锡的衍生主要包括使用Grignard试剂(含卤化镁的有机金属化合物)或烷基硼酸盐(通常是NaBEt4)进行烷基化或使用硼氢化物(如硼氢化钠NaBH4)进行转换。NaBEt4由于其在水相基质中的应用以及具有在线和离线状态下均能同时进行衍生和提取的功能［34］，不需要分解多余的衍生试剂且生成物比较稳定，是最被常用到的试剂。而Grignard试剂因其需要较为专业的处理技术和干燥条件来避免与水、酸、酮和醇发生反应影响检测结果，很少用于有机锡的衍生。NaBH4剧烈的氢化衍生反应中会有气泡产生，会带走氢化后的OTs，重现性不理想，NaBEt4的衍生就较为简单，在水相中就能把有机锡转化为其乙基衍生物。然而衍生过程中必须调节pH(pH4～6)，使乙基可以亲核取代有机锡阳离子。NaBH4可能会受到复杂的基质(如生物和沉积物)的干扰，主要源自与金属的反应和金属硼化物的生成(抑制生成Sn H键)［31］。通过比较目前国内外的衍生方法优劣，最终本研究选用NaBEt4作为衍生试剂。

表2 线性范围、线性回归方程，相关系数和检出限Table 2 Linear regression equation，correlation coefficient and detection limit

2.4 标准曲线和检出限

按1.2实验方法所示对10、20、50、200、500、1000μg/L的OTs混合标准溶液衍生后进行GC－MS测定，将9种OTs的质量浓度作为横坐标，将对应的定量离子积分峰面积作为纵坐标，绘制后得到标准曲线，在10～1000μg/L范围里9种OTs的质量浓度与对应的峰面积呈线性，相关系数在0.9952～0.9988之间，检出限(3S/N)为0.4～1.0μg/kg(干重dw，以Sn计)。依照3倍的信噪比得到9种OTs的检出限，10倍信噪比计算定量限，详见表2。经GC－MS分析后总离子流色谱图如图2。

图2 混合标准溶液的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatogram of a mixed standard solution

2.5 方法的精密度和回收试验

称取1.00 g小黄鱼样品，同一样品重复测定5次作为平行，结果如表3，同时对小黄鱼样品进行低(2μg/kg)、中(20μg/kg)和高(200μg/kg)3个浓度水平的加标回收试验，同样平行测定5次，结果如表3。样品含量均以Sn计。

从表3得出，3种加标浓度下加标回收率为81.2%～115.0%，相对标准偏差为4.1%～7.5%之间，其中在2μg/kg低浓度加标水平下回收率为96.4%～115.0%，相对标准偏差为4.1%～7.5%，在20μg/kg中浓度加标水平下回收率为81.2%～101.8%，相对标准偏差为4.1%～6.5%，在200μg/kg高浓度加标水平下回收率为83.2%～100.9%，相对标准偏差为4.2%～6.2%。结果表明在3种不同的加标浓度下样品加标均有较好的回收率，相对标准偏差也在较小的范围内，测定结果的精密度、准确度都满足要求。

表3 精密度和回收试验结果(n=5)Table 3 Precision and recovery test results(n=5)

表4 样品分析结果(湿重，以Sn计，μg/kg)Table 4 Sample analysis results(wet weight，in terms of Sn，μg/kg)

2.6 样品分析

按照试验方法分别对市售的龙头鱼、梅童鱼、小黄鱼、大黄鱼、带鱼、鲳鱼、海鳗、哈氏仿对虾、口虾蛄、梭子蟹、缢蛏、牡蛎等海产品中OTs进行检测，结果表明，梅童鱼、小黄鱼、大黄鱼、海鳗中均未检出9种OTs。在龙头鱼、带鱼、鲳鱼、哈氏仿对虾、口虾蛄、梭子蟹、缢蛏、牡蛎中，除MOT、TeBT、DOT未检出外，其余OTs均有被检出，9种OTs总量为ND～162.0μg/kg(ww，以Sn计)。其中贝类中苯基锡(5.8～89.4μg/kg)的含量均高于丁基锡(ND～0.6μg/kg)、辛基锡(ND)，也高于除鲳鱼(13.0～22.1μg/kg)外的所有鱼类(ND～14.2μg/kg)和甲壳类(ND～3.3μg/kg)样品，说明贝类较鱼类和甲壳类更易富集苯基锡，也许是因为软体动物携有稍强的产生金属结合蛋白的本领［35］。由此可见，舟山市沿海的海产品已存在有机锡污染现象，尤其是TPhT的污染最为严重，需引起消费者注意。

3 结论

本文建立了超声波萃取，冷冻脱脂，衍生前后分别进行分散固相萃取净化，气相色谱质谱法测定海产品的OTs的检测方法。在优化条件下，9种有机锡化合物的线性范围为10～1000μg/L，检出限(3S/N)为0.4～1.0μg/kg(dw，以Sn计)。在2.00、20.0和200μg/kg 3个添加水平的回收率为81.2%～115.0%，相对标准偏差为4.1%～7.5%(n=5)。该方法相比凝胶渗透色谱、固相萃取净化等有机溶剂消耗量大，耗时较长等缺点，大大提高了检测速度。另外，根据舟山市售海产品中OTs检测结果，龙头鱼、带鱼、鲳鱼、哈氏仿对虾、口虾蛄、梭子蟹、缢蛏、牡蛎中9种OTs总量为ND～162.0μg/kg(ww，以Sn计)，说明海产品已存在一定水平的有机锡污染，应当引发相关部门和消费者的重视。下一步应开发新型的萃取净化的方法，使前处理过程更加简便高效，同时根据有机锡化合物的特性开发更多分析技术用于检测不同形态的有机锡化合物，从而提高对海产品中各类有机锡化合物的监测水平，保障消费者的食品安全需求。