含高浓度透明质酸移植液对IVF-ET临床结局的影响

李瑞岐，区颂邦，廖早文，林海燕，李迪，张清学，王文军*

(1.中山大学孙逸仙纪念医院生殖内分泌专科，广州 510120；2.喀什地区第一人民医院生殖医学中心，喀什 840000)

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是一种非硫酸化的糖胺聚糖聚合物，天然存在于许多哺乳动物组织细胞外基质和细胞间质中，也是女性生殖道中含量最丰富的大分子之一[1]。EmbryoGlue是一种专用于胚胎移植的富含HA(0.5 mg/ml)的试剂。一些临床研究显示，EmbryoGlue作为移植液，可提高胚胎植入率和临床妊娠率[2-4]。一些临床研究结果并不支持该结论[5-7]。使用富含HA的培养基作为移植液的临床效果，在国内外仍存在较大争议。因此，为进一步明确EmbryoGlue对胚胎移植患者临床结局的影响和使用范围，本研究回顾性分析了在同一时间段内使用EmbryoGlue(Vitrolife，10085，瑞典)或者G2囊胚培养基(Vitrolife，10132，瑞典)作为移植液进行胚胎移植的患者的临床结局。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析2018年8月至2019年1月在中山大学孙逸仙纪念医院行IVF助孕的患者临床资料。纳入标准：(1)女方年龄≤45岁；(2)新鲜胚胎移植周期或者FET周期；(3)胚胎移植液为EmbryoGlue或者G2培养基。排除标准：二步移植周期、晚补救ICSI周期、移植日胚胎质量未达到可用胚胎标准的周期。

本研究共纳入符合标准的患者胚胎移植资料1 207个周期，根据所用移植液不同分为EmbryoGlue组(n=596)和G2组(n=611)。

二、研究方法

1.胚胎培养：本研究所有患者的配子和胚胎均使用Vitrolife公司G5系列培养基进行体外受精和胚胎培养。受精当天(D0)患者配子以及ICSI后的卵母细胞均培养在G-IVF培养基中过夜培养。取卵第2天(D1)将受精卵转移至平衡过的G1培养基培养至D3。如果进行囊胚培养，则在D3时将胚胎移入平衡过的G2培养基培养至D5或者D6。D0至D3培养环境为37℃、6%CO2、饱和湿度培养箱。囊胚培养时，培养环境为37℃、6%CO2、5%O2饱和湿度培养箱。

2.胚胎解冻：本研究所有冷冻液和解冻液分别为玻璃化冷冻液(加滕，VT101，日本)和玻璃化解冻液(加滕，VT102，日本)。胚胎解冻前预热1号解冻液至37℃，2～4号解冻液平衡至室温。解冻时将装有胚胎的载杆从液氮拿出后快速摔下载杆上的液氮，并迅速将载杆的前端浸入1号解冻液，1 min后将胚胎分别转移至2～4号解冻液，停留时间分别为3 min、5 min、5 min。结束后，将胚胎培养至G2培养基，观察胚胎存活情况并评分。在胚胎移植开始前1 h，挑选所要移植的胚胎至移植液(EmbryoGlue或G2)中。

3.观察指标：临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%，胚胎种植率=孕囊数/移植胚胎数×100%，活产率=活产周期数/移植周期数×100%，流产率=流产周期数(包括异位妊娠)/临床妊娠周期数×100%。

四、统计方法

结 果

一、两组患者的基本临床资料及妊娠结局比较

本研究共纳入1 207个胚胎移植周期，EmbryoGlue组和G2组分别为596和611个周期，除EmbryoGlue组的胚胎移植数显著低于G2组(P<0.05)外，两组患者的其他基本临床资料以及临床妊娠结局比较均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

表1 两组患者的基本临床资料及妊娠结局比较[(-±s)，%]

二、行卵裂期胚胎移植的两组患者基本情况及妊娠结局比较

患者中行卵裂期胚胎移植的共有836个周期，EmbryoGlue组和G2组的周期数分别为408和428个周期。两组患者基本资料除移植胚胎数[(1.84±0.50)vs.(1.87±0.46)](P<0.05)外，其他基本资料比较均无统计学差异(P>0.05)；两组患者的临床妊娠率、胚胎种植率、活产率以及流产率无论是在新鲜周期还是FET周期，差异均无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 卵裂期胚胎移植的两组患者基本情况及妊娠结局[(-±s)，%]

三、EmbryoGlue对囊胚移植妊娠结局的影响

患者中行囊胚移植的共有371个周期，EmbryoGlue组和G2组的周期数分别为188和183个周期，两组患者的一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)；新鲜周期囊胚移植的周期数较少(n=65)，各项临床结局观察指标均无显著性差异(P>0.05)；FET周期囊胚移植的结果显示，EmbryoGlue组的临床妊娠率和种植率均显著高于G2组(P<0.05)，EmbryoGlue组的活产率虽然高于G2组，但差异尚未达到统计学意义(P>0.05)，两组间的流产率无显著性差异(P>0.05)(表3)。

表3 囊胚移植的两组患者基本情况及妊娠结局[(-±s)，%]

四、EmbryoGlue对FET周期妊娠结局影响的Logistic回归分析

通过logistic回归分析，对可能影响FET囊胚移植临床结局的因素进行校正分析。结果显示，在校正女方年龄、治疗周期数、移植胚胎数、移植优胚数以及是否自然周期移植因素后，EmbryoGlue对临床妊娠率的影响仍然具有统计学意义(P=0.034)，对种植率和活产率的影响均无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 FET周期临床结局影响因素的多因素回归分析

讨 论

EmbryoGlue在IVF领域中已应用多年，但是其临床作用一直存在争议。早期有研究显示，EmbryoGlue有利于D3和D5新鲜胚胎移植的临床结局，尤其是对于高龄和胚胎质量较差以及有过胚胎着床失败史的患者，可以获得较好的临床妊娠率[3，8]。吴芳等[9]的研究结果也显示，使用EmbryoGlue作为移植液可以提高IVF-ET的妊娠率和种植率。而有的研究结果则相反[6，10]。本研究结果显示，EmbryoGlue作为移植液可以改善FET周期囊胚移植的临床结局。但是对于D3卵裂期胚胎，EmbryoGlue未改善其临床结局，与其他研究报道结果一致[11]。另外，我们还进一步分析了新鲜移植周期和FET周期的临床结局，结果无论是新鲜移植还是FET移植，EmbryoGlue同样未改善卵裂期胚胎移植的临床结局。

刘辉等[5]在其研究中指出，EmbryoGlue作为移植液并不能改善D2、D3和D5胚胎移植的临床结局，在D3移植组中，EmbryoGlue组的活产率反而要低于G2组，流产率显著高于G2组。张克荣等[12]的研究结果显示，EmbryoGlue可以改善卵裂期移植周期的临床妊娠率，但是其研究中未纳入流产率的观察指标。Hambiliki等[13]的研究结果显示，EmbryoGlue能够提高卵裂期胚胎FET周期的胚胎种植率，但是存在较高的流产率和生化妊娠率，以至于最终的活产率相似。同样，最近王致辉等[14]的研究也显示，EmbryoGlue用于卵裂期胚胎移植时也存在较高的流产率。在本研究中，对于卵裂期胚胎而言，尽管EmbryoGlue组的流产率与G2组相似，但是对于临床结局而言，EmbryoGlue并未表现出任何优势，反而G2组的临床观察指标要稍好于EmbryoGlue。提示在卵裂期胚胎移植时选择G2作为移植液可能更为合适。原因可能是由于 EmbryoGlue 中富含的透明质酸虽然增强胚胎与子宫内膜之间的附着，但是也抑制了胚胎在宫腔的游走，阻止了卵裂期胚胎选择合适的种植位点，导致胚胎种植后引发早期流产[15]。

另外，在哺乳类动物的卵泡、输卵管、子宫黏液中都存在HA。有研究表明，HA在小鼠胚胎着床期被大量表达[16]，同时HA的主要受体CD44在小鼠囊胚滋养层和内细胞团细胞，以及植入期子宫内膜的基质中高表达，并且在人的子宫内膜中也有类似的发现[17]，表明HA对胚胎种植非常重要。Wang等[11]通过比较卵裂期和囊胚期胚胎中两个主要的HA受体的表达水平，发现CD44和透明质酸介导的运动受体(RHAMM，也称为细胞内透明质酸结合蛋白，IHABP)在囊胚中的表达水平显著高于8-细胞期胚胎。由此以上研究可以推断，在移植液中添加透明质酸有利于囊胚期胚胎和子宫内膜间的相互作用，诱导胚胎着床。而对于卵裂期胚胎移植，HA的添加可能为时过早，作用效果不大。本文研究的临床结果也与此相一致。

总之，本研究结果显示，EmbryoGlue未改善新鲜周期和FET周期的卵裂期胚胎移植结局，但是可以改善FET囊胚移植的临床结局。是否能够改善新鲜囊胚移植周期的临床结局还需要大样本量的临床研究进行证实。