第1 代Sabin 株脊髓灰质炎灭活疫苗D 抗原含量国际标准品的国际协作标定

江征，朱文慧，宋彦丽，刘婷，张雪子，英志芳，王剑锋，李长贵

中国食品药品检定研究院,北京102629

全球根除脊髓灰质炎(简称脊灰)认证委员会(Global Commission for The Certification of Poliomyelitis,GCC)于2015 年9 月20 日宣布全球已根除Ⅱ型野生脊灰病毒(wild polio virus typeⅡ,WPVⅡ)。2016 年,口服脊灰减毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine,OPV)中去除了Ⅱ型成分,由三价OPV(trivalent OPV,tOPV)转换为二价OPV(bivalent OPV,bOPV),目的是消除OPVⅡ型衍生病毒导致的相关病例。同时在计划免疫程序要求引入至少一剂脊灰灭活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine,IPV),以维持儿童对Ⅱ型脊灰病毒的免疫力。随着根除脊灰的进展,实验室暂存和使用野生脊灰病毒将受到严格控制,因此,采用Sabin 减毒株生产脊灰灭活疫苗更安全。目前,对IPV 的需求不断增加,许多制造商正在或计划生产sIPV,且已有sIPV 在中国和日本上市使用［1-3］。

IPV 的效力在体外采用经验证的ELISA 法及合适的参考物质进行测定,以D 抗原单位(DU)表示。目前,制造商和质控实验室将WHO 以野毒株生产的第3 代传统脊髓灰质炎灭活疫苗(conventional inactivated poliomyelitis vaccine,cIPV)国际标准品(international standard,IS)12 ／ 104 用于校准实验室参考品,来检测WPV IPV 产品中的D 抗原含量和体内大鼠效力评价［4］。在缺乏具体的sIPV 参考标准和明确规定剂量要求的情况下,sIPV 产品抗原标识含量差异较大。随着sIPV 生产和需求不断增长,建立适用于sIPV 抗原含量检测的国际标准品尤为重要,以实现sIPV 产品的全球标准化。2015 — 2016年的一项国际合作研究发现,IPV 国际标准品12 ／104 作为参考来测量sIPV 产品的效价时,无效试验的比例较高,且实验室结果间差异较大；当以sIPV样品作为参考来确定sIPV 研究样本的效力时,试验有效性和实验室间的一致性得到了改善［5］,因此WHO 决定建立专门针对sIPV 产品的新国际标准品。2017—2018 年,WHO 和NIBSC 组织开展了第1 代sIPV D 抗原含量国际标准品的协作研究,中国食品药品检定研究院(简称中检院)呼吸道病毒疫苗室受邀参加此次协作标定,现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品 sIPV 候选标准品 17 ／ 130(复样,编号为17002 和 17005)和 17 ／ 160(复样,编号为 17004 和17007)分别为已批准上市的制造商提供的商业生产规模的浓缩三价sIPV 原液,由NIBSC 分装为0.5 mL ／安瓿(未添加任何成分),分装过程随机抽样进行装量和无菌检查,均符合规定；监测样品17 ／ 134(编号为 17001)来源与 17 ／ 160 相同,由 NIBSC 稀释制成疫苗剂量样品；样品17 ／ 131(编号为17003)为不同于sIPV 候选标准品的第三家生产厂家提供疫苗原液,由NIBSC 手动无菌分装；样品17 ／ 161(编号为17006)由与候选标准品17 ／ 130 相同制造商生产的原液制备的国家参考品,在NIBSC 汇集后重新分装；cIPV IS 12 ／ 104 的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型标识效价分别为 277、65 和 248 DU ／ mL；cIPV IS 的替代参考制剂08／143 的Ⅰ型、Ⅱ型及Ⅲ型标识效价分别为381、82 和288 DU ／ mL。所有样品干冰运输至各参加协作标定单位,于-70 ℃保存。

1.2 主要试剂及仪器 BD-Difco®脱脂奶粉(货号:232100)购自BD 美国公司；Sigma®牛血清白蛋白(货号:HZB0148)购自美国Sigma 公司；Tween 20(货号:85113)、GibcoTM磷酸盐缓冲液PBS(pH 7.4,货号:10010031)、CorningCostar®96 孔酶标板和 ThermoMultiskan Ascent 酶标仪均购自美国ThermoFisher 公司。

1.3 实验设计 选择欧洲、美洲和亚洲共13 家单位(7 家制造商实验室和6 家国家质控实验室,大部分单位参加过2015—2016 年NIBSC 组织的sIPV疫苗D 抗原效力检测标准化第一次国际协作研究)进行协作标定。要求各单位分别采用统一方法和自建方法对编号 17001 ～ 17007 的 sIPV 样品和 12 ／104、08 ／ 143 进行 ELISA 试验,NIBSC 提供统一方法的标准操作程序和各检测样品的推荐稀释度。每个血清型进行3 次独立检测,每次试验包含所有的样品,并使用新打开的安瓿制剂。以12 ／ 104 及两种候选标准品为参考标准计算样品的D 抗原含量。每次检测原始数据、效力计算结果和试验有效性统计标准按要求统一报告给NIBSC 进行汇总统计分析。

1.4 统一方法 所用试剂均由NIBSC 统一提供,并按NIBSC 推荐配制方案自行配备,试验过程按照NIBSC提供的SOP 进行操作。用碳酸盐缓冲液包被羊源多克隆捕获抗体,50 μL ／ 孔,2 ～ 8 ℃反应过夜；用洗液1(PBS + 2%脱脂奶粉+ 0.5% Tween 20)洗涤4次,室温封闭30 min；加入稀释样品(按NIBSC 推荐稀释度进行稀释),50 μL ／ 孔,每个稀释度设 2 个复孔,37 ℃反应2 h；用洗液1 洗涤3 次,加入鼠源单克隆检测抗体(按NIBSC 推荐稀释度进行稀释),50 μL ／ 孔,37 ℃反应 1 h；用 PBS 洗涤 3 次,加入显色试剂 OPD,50 μL ／ 孔,室温黑暗放置 30 min；用1 mol ／ L 硫酸终止反应,用酶标仪检测 A492值。

1.5 自建方法 各参加单位使用自建ELISA 体系进行检测。中检院自建方法中各试剂均由本实验室保存。用碳酸盐缓冲液包被牛源多克隆捕获抗体,100 μL ／ 孔,2 ～ 8 ℃孵育过夜；用洗液 2(PBS + 1%牛血清白蛋白+ 0.5% Tween 20)洗涤3 次,室温封闭 1 min；加入稀释样品,100 μL ／ 孔,每个稀释度设2 个复孔,37 ℃反应过夜；用洗液2 洗涤3 次,加入兔源多克隆检测抗体,100 μL ／ 孔,37 ℃反应 2 h；用洗液 2 洗涤 3 次,加入二抗,100 μL ／孔,37 ℃反应2 h；用洗液 2 洗涤 4 次,加入 TMB,100 μL ／ 孔,室温黑暗放置 30 min；1 mol ／ L 硫酸终止反应,用酶标仪检测A450和A620值。

1.6 统计学分析 依据第1 次国际协作研究经验,不同实验室不同型别反应数据可能需要不同类型的分析模型:保证反应线性部分保留至少3 个稀释度的前提下,大多数实验室使用平行线法计算样品相对参考标准效力；为获取线性剂量反应关系,有的实验室反应数据可能需做对数转换处理,且在同一实验室同一检测方法下所有型别数据转换要保持一致；另外有的实验室自建方法使用四参数模型计算相对效力。

所有数据统一采用NIBSC 官方软件CombiStats进行有效性分析和结果计算［6-7］。平行线模型的适用以试验有效性成立为前提,判定试验无效或不适用平行线法计算的依据包括:剂量反应数据目视明显不呈线性；测试样本剂量-反应范围与协标参考标准不重叠；测试样本与参考标准呈非平行关系。其中对样品和参考标准平行关系成立的有效性标准是通过采用重复样本相对于彼此的斜率比(即候选标准17 ／ 130样品编码17002 与17005 的相互比,候选标准17／160样品编码17004 与17007 的相互比)分别定义每种血清型的平行性接受标准。通过公式m = max(s,1 ／ s)计算m 的非参数上限值(95%置信度),其中s 表示一个试验中复样的斜率比,取该界值及其倒数值定义为一个可接受的呈平行关系的斜率比范围。

汇总所有有效的结果计算产生每个实验室和总体未加权D 抗原含量几何平均值(geometric mean,GM)。实验室内和实验间的结果变异程度用几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)表示,按下列公式计算。

GCV(%)=(10 s - 1)× 100%

式中s 为log10 转换效力的标准偏差。

2 结 果

2.1 平行关系成立的有效性标准 规定时间内共收到12 个实验室的检测数据,采用前10 个按时间顺序提交的实验室数据计算样品和参考标准呈平行关系的斜率比范围,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的斜率比范围分别为0.66 ～ 1.51、0.70 ～ 1.43、0.65 ～ 1.54。

2.2 试验有效性分析 呈现非线性的样本数据(约3%)被排除计算,见表1。采用上述平行性判定标准,在 08 ／ 143 与 12 ／ 104 之间未发现不平行情况。当采用候选参考标准时对比12 ／ 104,平行性未发生一致性改善,但对所有Ⅱ型测定具有较好的提升。当实验室采用自建方法时,排除计算的数据比例较采用统一方法时更少。以17 ／ 160 作为参考标准时,采用任一方法的平行性均比采用17 ／ 130 更好。

2.3 实验室内变异 自建方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型实验室内变异范围分别为2.6% ～43.6%、2.0% ～21.6%及2.7% ～20.4%,统一方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型实验室内部变异范围分别为2.2% ～55.2%、2.2% ～46.5%和3.0% ～45.8%。总体上,有91.8%实验室检测结果的重复性高于20%,67%实验室检测结果的重复性高于10%,个别高变异值可能是由于单一的异常结果。当使用候选标准17 ／ 160 作为参考时结果略好。

2.4 实验室间变异 当采用自建方法,并以12／104为参考标准时,一些极端差异(最大GCV 为91.8%)集中来自两个实验室,因此这两个实验室的结果被排除在最终效力计算之外。当采用自建方法,以两个sIPV 候选标准为参考时,未出现极端差异,且与12／104的参考标准相比,实验室间一致性有所提升。各实验室采用统一方法测定的sIPV 样本D 抗原效力在实验室间差异较小,结果均纳入最终计算中。当采用12 ／ 104 作为参考无论采用何种方法,各实验室测量08 ／ 143 的效力差异均较小(最大 GCV 为 20.9%)。当采用sIPV 参考标准和检测样本来自同一制造商时,实验室间检测结果的一致性更优(GCV 平均低于10%)。无论采用何种检测方法,候选标准复样的检测结果间一致性均良好:各型别17 ／ 130 复样间相对比值范围为0.935 ～ 1.040,最大 GCV 为21.1%；各型别 17 ／160复样间相对比值范围为0.961 ～1.018,最大GCV 为11.0%,后者略优于前者。见表1。

2.5 候选标准的D 抗原效力 以12 ／ 104 为参考标准时,候选标准品 17 ／ 130 的 I、Ⅱ和Ⅲ型 D 抗原含量几何平均值分别为 50、608 和 450 DU ／ mL,17 ／160 的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型D 抗原含量几何平均值分别为239、136 和 237 DU ／ mL,见图 1。

表1 试验有效性及实验室间变异情况(%)Tab.1 Assay validity and inter-laboratory variability(%)

图1 以不同标准品检测各样品的D 抗原含量GMFig.1 Geometric mean of D-Ag contentdetermined by using various standards

2.6 中检院检测情况 采用自建方法的Ⅲ型检测结果与总体平均估计值有较大偏离,因此未纳入研究统计评价中。采用统一方法检测的所有结果均满足平行性可接受标准,纳入最终赋值统计计算,实验室内部变异为5.6% ～9.9%,表明本实验室操作精准度良好。

3 讨 论

在2015—2016 年第1 次sIPV 标准化国际协作研究的基础上,确定了本次协作标定的研究方案和候选标准材料,并沿用了第1 次协作研究的各参加单位。本次研究结果证实了第1 次协作研究的结论,即现行国际cIPV 标准品12 ／ 104 作为标准测定sIPV 产品中D 抗原含量的做法并不是最佳选择,主要由于检测结果在实验室自建方法间变异度较高。当采用两种sIPV 候选标准材料作为标准时,sIPV 产品D 抗原结果的实验室间一致性得到了明显提升。另外,两个候选标准的重复样品的D 抗原含量GM在实验室内和实验室间均有较好的一致性。上述结果表明,两种sIPV 候选标准材料均具有作为sIPV D抗原含量测定的国际标准品的潜力。

NIBSC 开展的稳定性研究表明,这两种候选标准材料在长期储存(-70 ℃)和短期实验室操作的温度下(4 ～20 ℃)均是稳定的。但两种材料在-20 ℃储存期间的稳定性较差,特别是17 ／ 160 保存9 个月后基本检测不到D 抗原。在4 ℃储存9 个月,17／130的效力有所下降,但17 ／ 160 的效力保持相对稳定。因此,综合协作标定和稳定性研究结果得出结论:候选材料 17 ／ 130 和 17 ／ 160 均适合作为 sIPV D 抗原含量检测国际标准；目前17 ／ 160 在试验有效性、实验室内和实验室间的一致性和整体热稳定性方面的总体结果略好,因此被选定为第1 代sIPV D 抗原含量检测的国际标准品,标识的效价Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型分别为 239、136 和 237 DU ／ mL［8］。

目前各sIPV 实验室自建的ELISA 检测方法形式多种多样,包括不同的捕获和检测抗体组合、重复样品数量和每个样品的稀释度数目、不同的检测用底物和计算D 抗原量的统计分析方法等。采用统一检测方法之后,无论使用何种材料作为标准去检测sIPV 抗原含量,实验室间的差异大幅减小,原因可能是统一方法的操作在一定程度上避免了不同检测方法差异带来的影响。另外,无论是否统一检测方法,以cIPV 或sIPV 作为标准检测sIPV 样品时,不同实验室间均显示良好的一致性,尤其是当标准和样品来自同一生产厂家时,实验室间一致性最好,可能是由于生产工艺不同,如不同的蛋白质-甲醛相对浓度等,导致来源相同毒株的不同产品一些表位结构出现了微小差异。因此,建立sIPV 国际标准品后的标准化研究,可考虑进一步优化协调实验室间的D 抗原ELISA 检测方法,或建立适用于不同sIPV 产品的放行检测方法,如建立对不同sIPV 产品和 ／ 或cIPV 产品具有相似反应活性的抗体试剂等。

基于cIPV 和sIPV 的抗原特性差异及建立同源参考物质以精确测量有效成分的必要性,防止未来使用sIPV 国际标准赋值与cIPV 产生混淆,国际上提议一个独立于cIPV 效力的D 抗原单位(DU)的新抗原单位,即Sabin D 抗原单位(SDU),专门用于定义sIPV 产品。2019 年WHO 标准物质委员会同意将推荐的候选标准材料17 ／ 160 作为第1 个sIPV D抗原含量的国际标准品,并赋予Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型效价分别为100 SDU ／ mL,用于校准sIPV 的二级参考品。目前该新国际标准仅被验证用于体外试验,WHO 标准物质委员会提议将进一步研究评估其用于大鼠体内效力测定的适用性,并根据全球现状提出了有效的使用建议:现有已获得许可和处于后期开发阶段的sIPV 产品制造商,已根据其使用DU 表示了效力值,在获得国家监管机构(National Regulation Authority,NRA)批准的情况下可继续使用已经标识DU 的内部参考效力值；同时建议根据sIPV 国际标准品测定其sIPV 产品的SDU 效力值,并建立“SDU”与“DU”之间的相关性,作为一个关键的质量属性,确保产品间的可比性［9-10］。