冠心病患者血清miR-21、miR-29a表达水平与心电图QRS波时限相关性分析

孙玉敏，李 绒

(1.延安市人民医院功能科，陕西 延安 716000；2.陕西省核工业二一五医院功能科，陕西 咸阳 712000)

冠心病(Coronary heart disease，CHD)发病基础是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)病变，可形成血栓，引起血管狭窄、堵塞，从而造成心肌缺血，且发病率呈逐年上升趋势[1-2]。CHD发病除与高血糖、异常血脂、高血压、炎症等易引发冠状动脉硬化等因素有关外，还与表达失调的微小RNA(MicroRNA，miRNA)密切相关[3-4]。miRNA-21(miR-21)在冠状动脉疾病中表达上调，可能成为冠状动脉疾病发生与发展的生物指标[5]。miRNA-29a(miR-29a)在AS患者中呈高水平，可能影响AS发生与发展[6]。但miR-21、miR-29a在CHD患者血清中的表达水平与心电图QRS波时限的关系鲜有报道。因此，本研究通过测定CHD患者miR-21、miR-29a表达水平，并分析两者与QRS波时限的关系，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2017年4月至2019年2月本院接诊的162例CHD患者作为CHD组，其中男性119例，女性43例；年龄50～72岁，平均(58.64±5.81)岁。病例纳入标准：①符合CHD诊断标准[7]；②结合临床表现，且经心肌酶学、心电图、冠状动脉造影诊断并确诊为CHD患者；③检查资料完整。排除标准：①脂肪肝、免疫性疾病、中毒性肝炎、急慢性感染、肺源性心脏病者；②近期脑血管意外、手术、永久心脏起搏器植入者；③恶性肿瘤、胆囊炎、慢性结缔组织疾病、胆石症、严重肝肾功能不全、风湿性瓣膜性心脏病者；④先天性心脏病、慢性阻塞性肺疾病、高血压性心脏病者；⑤有肝病史者；⑥近期内服用影响QRS波时限药物者。选择同期166例体检正常者作为对照组，其中男性109例，女性57例；年龄49～71岁，平均(57.90±5.72)岁。受试者或家属已签署知情同意书。本研究方法符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 检测方法

1.2.1 样本收集：收集CHD患者入院次日、体检者体检当日约5 ml空腹外周血，分离血清(3450 r/min离心10 min)后分装，-80 ℃冻存于冰箱中。

1.2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定血清miR-21、miR-29a水平：解冻适量血清，添加TRIzol裂解液(批号：GMS12279；深圳子科生物科技有限公司)，抽提总RNA。以紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度。利用miScript Reverse Transcription Kit(批号：218061；北京绿源伯德生物科技有限公司)将RNA反转录成cDNA。以Taq Man®Fast Advanced Master Mix(批号：444963；上海恒斐生物科技有限公司)制备反应体系，使用qRT-PCR仪进行扩增、检测。miR-21、miR-29a均以U6为内参，引物序列如表1所示。miR-21、miR-29a相对表达量以2-△△CT法计算。

表1 miR-21、miR-29a及内参U6引物序列

1.2.3 心电图QRS波时限测量：利用心电图机同步记录所有研究对象标准12导联体表心电图(走纸速度25 mm/s，刻度0.1 mV/mm)。以12导联中最宽QRS波计算QRS波时限。

1.2.4 酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)水平：使用人TNF-α ELISA试剂盒(批号：YM-SZ0122；上海远慕生物科技有限公司)、MMP-2 ELISA试剂盒(批号：DG11383H；北京冬歌博业生物科技有限公司)配制TNF-α、MMP-2标准样品溶液，于450 nm波长处测定标准品溶液吸光度，绘制TNF-α、MMP-2回归曲线。测定血清样本吸光度，与TNF-α、MMP-2标准回归方程结合计算二者水平。

2 结 果

2.1 两组一般资料比较 见表2。CHD组三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白水平较对照组升高，高密度脂蛋白较对照组降低(均P<0.05)。

表2 两组一般资料比较

2.2 两组血清miR-21、miR-29a相对表达水平及QRS波时限比较 见表3。CHD组心电图QRS波时限较对照组明显延长，血清miR-21、miR-29a表达水平较对照组明显升高(均P<0.05)。

表3 两组血清miR-21、miR-29a相对表达水平及QRS波时限比较

2.3 两组血清MMP-2、TNF-α水平比较 见表4。CHD组患者血清MMP-2、TNF-α水平较对照组明显升高(均P<0.05)。

表4 两组血清MMP-2、TNF-α水平比较

2.4 CHD患者血清miR-21、miR-29a、QRS波时限与MMP-2、TNF-α相关性分析 见表5。Pearson相关性分析显示，CHD患者血清miR-21水平、miR-29a水平及QRS波时限与MMP-2、TNF-α均呈正相关(均P<0.05)。

表5 CHD患者血清miR-21、miR-29a、QRS波时限与MMP-2、TNF-α相关性

2.5 CHD患者血清miR-21、miR-29a水平与QRS波时限相关性分析 Pearson相关性分析显示，CHD患者血清miR-21、miR-29a与心电图QRS波时限均呈正相关(r=0.516、0.389，均P<0.05)。

2.6 CHD发生影响因素Logistic回归分析 见表6。以CHD是否发生为因变量，以三酰甘油、miR-21、总胆固醇、miR-29a、低密度脂蛋白、QRS波时限、高密度脂蛋白、TNF-α及MMP-2为自变量，行Logistic回归分析，结果显示miR-29a、QRS波时限、miR-21、MMP-2、TNF-α是影响CHD发生的危险因素(均P<0.05)。

表6 CHD发生影响因素Logistic回归分析

3 讨 论

冠心病以发作性绞痛、压榨痛为主要临床症状，且其病死率较高，对患者生理和心理健康构成严重威胁[8]。因此，寻找高效诊断和防治CHD的指标对提高CHD患者生命质量具有重要社会意义。

miRNA可参与调节炎症反应、氧化应激反应、信号转导等过程，也参与心肌肥厚、AS、心力衰竭等心血管类疾病[9-10]。miR-199a在心肌肥厚中表达异常，可影响心脏自噬，有望成为治疗心脏病的潜在策略[11]。miR-21-5p在心肌梗死患者血清中表达失调，其为发生心肌梗死的危险因素，在心肌梗死发展进程中发挥一定作用[12]。miR-23a在冠状动脉疾病中过表达，与冠状动脉狭窄严重程度有关，可作为冠状动脉疾病诊断和评估指标[13]。以上研究表明，miRNA异常表达与缺血性心血管疾病密切相关。miR-21是多种生物功能调节因子，在心力衰竭患者血清中表达上调，可能对心力衰竭的发生与发展至关重要[14]。miR-21-3p是miR-21成员之一，其在心肌肥厚中表达异常，有望成为心肌肥厚诊治靶标[15]。以上研究表明，心力衰竭、心肌肥厚、缺血性心血管系统疾病中miR-21异常表达可影响疾病发生与发展。本研究中miR-21在CHD组水平明显高于对照组，提示miR-21可能参与并影响CHD发生与发展进程。miR-29a在心肌肥厚中异常表达，其可能通过作用于过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)而影响心肌肥厚的发生与发展，有可能成为诊治心肌肥厚的有效靶标[16]。miR-29a在心力衰竭中表达异常，有望成为心力衰竭预后评估指标。本研究中miR-29a在CHD组患者血清中水平明显高于对照组，提示miR-29a可能在CHD发病过程中起一定作用。心电图QRS波时限与心功能有关，QRS波时限延长是评估冠心病预后及心功能的重要指标[17-18]。本研究显示CHD组患者QRS波时限长于对照组，提示QRS波时限可能影响并反映CHD发生与发展程度。

研究[19]显示，MMP-2在CHD患者外周血单个核细胞中表达升高，与冠脉造影粥样斑块病变分型、粥样硬化斑块分型具有一定相关性，其在冠状AS发展进程中发挥一定作用。TNF-α在CHD患者血浆中表达上调，是CHD发生的危险因素，可作为评估冠心病和冠脉病变程度指标[20]。本研究显示，CHD患者血清TNF-α、MMP-2水平高于对照组，猜测两者参与炎症反应，进而促进AS发展，影响CHD，提示TNF-α、MMP-2可能参与CHD疾病发展过程。此外，本研究中CHD患者血清miR-21、miR-29a水平及QRS波时限与MMP-2、TNF-α呈正相关，提示miR-21、miR-29a、QRS波时限可能与TNF-α、MMP-2共同影响CHD发生与发展。另外，CHD患者血清miR-21、miR-29a与QRS波时限呈正相关，提示miR-21、miR-29a与QRS波时限相互影响，进而在CHD发病进展中发挥作用。本研究中miR-21、miR-29a、QRS波时限、MMP-2、TNF-α是影响CHD发生的危险因素，提示QRS波时限延长及miR-21、miR-29a、TNF-α、MMP-2水平升高均可能增加CHD患病风险，及时动态监控上述指标有助于及早防治CHD。

综上所述，miR-21、miR-29a在CHD患者血清中高表达，两者均与QRS波时限呈正相关，共同影响CHD病理发展。但本研究未探究miR-21、miR-29a在CHD的作用机制，后续需深入研究。