添加不同有机氮源对L-赖氨酸发酵的作用

李朝波，翟秀超，温 琦，王世宾

无锡中粮工程科技有限公司 (无锡 214035)

L-赖氨酸(Lysine)是人体必需的8种氨基酸之一，在8种必需氨基酸中是唯一的仅L-型成分才能有效利用的[1]。L-赖氨酸是构成蛋白质的一种必需氨基酸，哺乳动物不能自行合成，且在谷物食品中含量极低，在加工过程中损失严重，所以被称为第一限制性氨基酸。2019年国内赖氨酸产能和产量分别达280万t和197万t，产品90%用于饲料养殖业[2]。目前，在L-赖氨酸的生产方法多为微生物发酵法，比较典型的菌种为大肠杆菌和谷氨酸棒状杆菌等[3]。国内赖氨酸生产技术已经达到国际领先水平，赖氨酸产量居世界第一[4]。

在发酵过程中，氮源主要用于构成菌体细胞和含氮目的产物，其中无机氮源是微生物生长的速效氮源，而有机氮源为菌体生长提供氮元素和必须的生长因子，对发酵起着至关重要的调控作用，可促进生长速率，调节初级代谢及次级代谢的通量；控制生长水平，启动次级代谢产物形成；控制生长速率，影响菌型形成，从而影响发酵产量；影响供氧水平，增加功率消耗[5]。因此添加不同有机氮源对培养基的优化意义重大[6]。

发酵培养基的成本直接影响着生产企业的盈利，如何降低发酵培养基原料成本，是企业利润提高的迫切需求。传统的L-赖氨酸发酵过程中，以硫酸铵为无机氮源，玉米浆、豆粕水解液和多肽粉等为有机氮源。本文结合生产实际，拟分别用玉米浆、菌体蛋白水解液[7]、菌体蛋白水解液加玉米浆混合物、豆粕水解液、多肽粉等作为有机氮源，研究不同有机氮源对L-赖氨酸发酵过程的影响，进而优化有机氮源的使用，降低生产成本、提高生产利润。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种

L-赖氨酸生产菌，Corynebacterium glutamicum JULY1801菌株。

1.1.2原材料

玉米浆、豆粕水解液、多肽粉、菌体蛋白，安徽亿辉生物科技有限公司，菌体蛋白水解液，实验室自制。

1.1.3设备与仪器

5 L发酵罐；721型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；M100型生物传感分析仪，深圳市西尔曼科技有限公司；E-10型铵离子分析仪，深圳市西尔曼科技有限公司；1 000 mL三角烧瓶；恒温摇床，太仓市强文实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1摇瓶培养

(1)摇瓶培养基及灭菌

培养基：葡萄糖110 g/L，氯化钠2.9 g/L，磷酸二氢钾5.7 g/L，蛋白胨16 g/L，VB10.005 g/L，丙酮酸钠0.005 g/L,硫酸铵13 g/L。

按上述配方称量药品，将药品置于烧杯中加水，用氨水调pH值 7.5，转入1 000 mL三角烧瓶，定容100 mL。装入灭菌锅，待温度升至121 ℃开始计时，温度控制在121 ℃～123 ℃，维持20 min。

(2)摇瓶种子培养

将接种后的摇瓶在内层8层纱布上扎上棉绳后，牛皮纸轻放在摇瓶上，放入摇床培养48 h。摇床转速200 r/min，培养温度37 ℃，每隔2 h监控1次温度。

1.2.2发酵罐培养

(1)种子培养基及灭菌

培养基：葡萄糖65 g/L，蔗糖24 g/L，磷酸二氢钾1.2 g/L，蛋白胨12 g/L，VB10.005 g/L，醋酸氨38 g/L，硫酸铵1 g/L。

将培养基溶解后加入锥形瓶，pH用氨水调节至6.9，加入泡敌0.5 mL，灭菌锅121 ℃灭菌20 min。

(2)发酵培养基及灭菌

培养基：葡萄糖40 g/L，蔗糖10 g/L，玉米浆12 g/L，硫酸镁9 g/L，氯化钾5.5 g/L，磷酸6 g/L，硫酸铵20 g/L。

将培养基溶解后加入锥形瓶，氨水调pH值至6.5，灭菌锅121 ℃灭菌23 min。

(3)培养

种子培养：在火焰保护下将一级种子按5%接种量接入5 L种子罐中，初始装液量3 L。用氨水调节pH值至7.0，pH范围：6.9～7.0 。设置转速恒定700 r/min，风量恒定至1.5 L/min进行培养。若溶氧还不足，再提罐压至0.06～0.07 MPa。待种子培养液OD562值在1.0左右时，按照10%接种量接入发酵培养基中。

发酵培养：按照10%接种量将种子液接入到5 L的发酵罐中，初始通气量为1.0 L/min；搅拌转速200 r/min；pH通过流加氨水控制在6.9～7.0；培养温度37 ℃。当残糖和AN降至一定值时，将葡萄糖和硫酸铵溶液流加到培养基中；并以泡敌消泡防止泡沫外逃。

1.2.3测定方法

菌体含量：以OD值表示，发酵液稀释50倍后，用721分光光度计在波长562 nm下测量吸光度；残糖含量的测定：生物传感分析仪；氨氮含量的测定：铵离子分析仪；L-赖氨酸含量的测定，生物传感分析仪；溶氧的测定：溶氧电极。

2 结果与讨论

2.1 不同有机氮源对 L- 赖氨酸摇瓶发酵的影响

分别选取玉米浆、豆粕水解液、多肽粉、菌体蛋白水解液以及菌体蛋白水解液和玉米浆混配作为初始有机氮源，添加量为 12 g/L(菌体蛋白水解液和玉米浆混配时各6 g/L)，摇床培养48 h,测定结果见表1。

表1 不同有机氮源对 L- 赖氨酸摇瓶发酵的影响

通过摇瓶试验可知，玉米浆、菌体蛋白水解液、玉米浆和菌体蛋白水解液混配物都是良好的发酵有机氮源。为了进一步确定一种最优氮源，现分别用玉米浆、菌体蛋白水解液、玉米浆和菌体蛋白水解液混配物作为有机氮源用5 L发酵罐培养。

2.2 不同有机氮源对 L- 赖氨酸发酵罐发酵的影响

分别选取玉米浆、菌体蛋白水解液以及菌体蛋白水解液和玉米浆混配作为初始有机氮源，添加量为 12 g/L(菌体蛋白水解液和玉米浆混合时各6 g/L)，发酵罐培养36 h。

2.2.1不同有机氮源对 L- 赖氨酸发酵菌体生长的影响

由图1可以看出，不同有机氮源对L-赖氨酸生产菌的生长影响不大。3种不同有机氮源，在对数生长期的时间段一致，即均在3 h进入对数生长期，12 h进入稳定期。稳定期持续时间均在15 h左右。以玉米浆和菌体蛋白混配作为有机氮源时菌体对应的最大OD值略大，OD值约在1.04。

图1 不同有机氮源对 L- 赖氨酸发酵菌体生长的影响

2.2.2不同有机氮源对 L- 赖氨酸发酵产酸的影响

由图2可以看出，使用不同有机氮源发酵，在36 h停止发酵时，以玉米浆和菌体蛋白水解液1∶1混合的有机氮源的产酸量略大于以玉米浆、菌体蛋白水解液为有机氮源的产酸量。

图2 不同有机氮源对 L- 赖氨酸发酵产酸的影响

3.2.3不同有机氮源对赖氨酸发酵综合指标影响

由表2可以看出，使用不同有机氮源，在36 h停止发酵时，以玉米浆和菌体蛋白水解液混合使用的有机氮源的产酸量和糖酸转化率最髙，均优于以单品种玉米浆或菌体蛋白水解液为有机氮源的发酵指标。

表2 不同有机氮源对赖氨酸发酵综合指标影响

3 结论

影响L-赖氨酸发酵指标的因素很多，如菌种、培养基配方、培养条件、发酵过程控制等。其中有机氮源种类的选择对菌体生长和 L-赖氨酸的产量影响较大。本试验根据表2可以看出，玉米浆和菌体蛋白水解液混合使用作为L-赖氨酸发酵的有机氮源有利于产酸和提高转化率。且菌体蛋白是赖氨酸生产过程中的副产品，含有丰富的蛋白质、核酸、糖类及维生素等多种营养物质，是利用微生物发酵氨基酸的优质原料[8-11]。按年产4万t 98.5%赖氨酸计算，可回收理论菌体蛋白水解液2 800 t，将菌体蛋白作为有机氮源可以降低赖氨酸生产原料成本，并提高副产物的附加值。

玉米浆是以玉米制淀粉或制糖中的玉米浸泡水制得的，玉米在浸渍过程中，由于使用了一定量和浓度的亚硫酸，使种皮成为半透性膜，一些可溶性蛋白，生长因子、无机盐和糖类进入到浸渍水中，因而玉米浆含有丰富的营养物，它可按一定比例加入到玉米皮中，以弥补玉米纤维中蛋白质含量的不足，可以用于氨基酸的培养基[12]。

本文通过实验确定了玉米浆和菌体蛋白水解液混合使用作为 L-赖氨酸发酵的有机氮源，既能提高产酸量和糖酸转化率，又可在成本方面相对其它有机氮源占有明显的优势。