超声波辅助法提取核桃青皮总黄酮工艺及抗氧化活性研究

吕名蕊，张 旋，樊 璐，严 烨，惠卫甲,杨 雯

1.西安悟空检测科技有限公司 (西安 710000) 2.中粮工科(西安)国际工程有限公司 (西安 710082)

核桃青皮，亦称胡桃青皮或青龙衣，是核桃的外果皮，目前核桃青皮尚未得到有效的利用，一般都是作为废弃物堆放在田间、地头或是沟边，不仅会造成资源的极大浪费，还会严重污染生态环境[1,2]。现代研究发现核桃青皮含有的黄酮类化合物等在医学上有抗癌、抗菌和防衰老等功效[3-5]。核桃青皮成分分析研究表明核桃青皮黄酮类化合物含量丰富。目前，对核桃青皮中黄酮提取工艺的研究报道较少，通过对核桃青皮黄酮的提取，不仅能将核桃青皮资源很好的利用起来，而且也避免其分解产物污染环境。

利用超声波[6]产生的高速、剧烈的空化效应和震荡力，破坏植物细胞壁，使溶剂充分深入到细胞中，达到很好的提取效果。本文采用超声波辅助法从核桃青皮中提取黄酮，通过单因素试验，分别研究浸取时间、超声功率、超声温度、料液比和乙醇体积分数等因素对黄酮提取率的影响。通过单因素试验确定四个主要因素设计一个四因素三水平的正交试验，确定提取核桃青皮黄酮的最佳工艺条件。并对核桃青皮中黄酮对羟基自由基和DPPH自由基的清除作用进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 原料与仪器

新鲜核桃青皮，产于河南郑州，-20 ℃下冷藏；芦丁，购自南京苏朗医药科技开发有限公司；无水乙醇、NaOH、AlNO3、NaNO2、Tris、邻二氮杂菲、盐酸、七水合硫酸亚铁、Vc、DPPH、30%过氧化氢试剂，均为分析纯试剂。

KQ-100E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；UV-3600型紫外分光光度计，Shimadzu公司；XPE105DR型分析天平，梅特勒-托利多国际有限公司；LGL-10C型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；DK-8 AX型恒温水浴槽，上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1黄酮提取液的制备

将核桃青皮清洗干净，在-60 ℃下冷冻干燥48 h，粉碎，过40目筛，室温下储存干燥器中备用。采用超声辅助法乙醇浸取核桃青皮中的总黄酮，浸取液抽滤、浓缩，得到黄酮提取液，待测。

1.2.2芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准品在60 ℃下烘干至恒重，准确称取芦丁标准品[7-9](98%纯度) 8.80 mg，用70%的乙醇溶解，定容10 mL，摇匀后获得芦丁标准溶液，其质量浓度为0.862 4 g/L。

准确移取芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于50 mL容量瓶中，依次加入70%的乙醇10.0 mL和5%的NaNO2溶液2.0 mL，摇匀静置5 min后，加入 10%的 Al(NO3)3溶液2.0 mL，静置6 min，再加入5%的NaOH溶液20.0 mL，用70%的乙醇定容，混匀显色15 min，510 nm 处测定溶液的吸光值 A。以溶液的吸光值A对芦丁浓度C 作图(图1)，绘制芦丁标准曲线。拟合回归方程见公式(1)，根据公式(1)计算核桃青皮中黄酮的含量，由公式(2)得出核桃青皮中总黄酮的提取率。

图1 芦丁标准曲线

Y=13.189 9X-0.007 5(R2=0.999 2)

(1)

(2)

1.2.3核桃青皮黄酮含量的测定

准确称取核桃青皮粉末1.00 g，用不同料液比、不同浸取时间、不同超声功率、不同体积分数乙醇和不同提取温度进行浸取，抽滤后，将滤液定容至100 mL，得到核桃青皮提取物。向核桃青皮提取物中依次加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠，利用铝离子与黄酮类化合物上的羟基发生显色络合反应[10,11]，记录其510 nm处吸光度值A，根据公式(1)计算核桃青皮总黄酮的含量，由公式(2)计算核桃青皮总黄酮的提取率。

1.2.4单因素实验

1.2.4.1 料液比对黄酮提取率的影响

在超声功率350 W、超声温度30 ℃、浸取时间30 min、溶剂为70%的乙醇的条件下，分别将1.00 g核桃青皮粉末溶于10、15、20、25、30、35 mL 70%的乙醇中进行黄酮的提取，完成后测定并计算黄酮提取率[12]。

1.2.4.2 浸取时间对黄酮提取率的影响

在超声功率350 W、超声温度30 ℃、料液比(g/mL)1∶30、溶剂为70%乙醇、浸取时间10、20、30、40、50、60 min的条件下对核桃青皮中黄酮进行提取，完成后测定并计算黄酮提取率。

1.2.4.3 超声功率对黄酮提取率的影响

在料液比(g/mL)1∶30、超声温度30 ℃、浸取时间60 min、溶剂为70%乙醇、超声功率(200、250、300、350、400、450 W)的条件下对核桃青皮中的黄酮进行提取，完成后测定并计算黄酮提取率。

1.2.4.4 超声温度对黄酮提取率的影响

在6个100 mL圆底烧瓶中，分别加入1.00 g核桃青皮粉末和30 mL 70% 乙醇，超声功率400 W，浸取时间60 min，考察不同温度(30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃)对核桃青皮中的黄酮进行提取，完成后测定并计算黄酮提取率。

1.2.4.5 乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

分别称取1.00 g核桃青皮粉末置于6个100 mL圆底烧瓶中，在料液比(g/mL)1∶30、超声功率400 W、浸取时间60 min、超声温度50 ℃条件下，考察乙醇体积分数(40%、50%、60%、70%、80%、90%)对核桃青皮中的黄酮进行提取，完成后测定并计算黄酮提取率。

1.2.5正交实验

根据单因素试验结果，分别选择超声功率、浸取时间、料液比及乙醇体积分数作为考察因素，以总黄酮提取率为考察指标，进行L9(34)正交试验。

1.2.6核桃青皮黄酮的体外抗氧化活性测定

1.2.6.1 核桃青皮黄酮对羟基自由基清除能力的测定

采用水杨酸法[13,14]测定核桃青皮黄酮的·OH清除能力。以蒸馏水为参比溶液，测定体系510 nm处的吸光度Ax，A0为所测溶液浓度为0时溶液的吸光度，同时用水代替H2O2溶液测得吸光度Ay，以VC作为对照，OH清除率用公式(3)计算得到，3次平行试验求清除率的平均值。

(3)

1.2.6.2 核桃青皮黄酮对DPPH自由基清除能力的测定

核桃青皮黄酮对DPPH自由基清除能力的测定在Kumaran课题组[15]实验方法上稍加修改。取一定浓度黄酮提取液2 mL于10 mL 的棕色比色管中，加入无水乙醇1 mL，0.1 mol/L的DPPH 自由基的无水乙醇溶液3 mL，摇匀，室温避光下，反应30 min，记录溶液517 nm处的吸光度A，以蒸馏水代替待测液作为空白，以VC作为对照。样品对DPPH 自由基的清除能力用公式(4)计算得到，3次平行试验求清除率的平均值。

(4)

式中，A0表示2 mL 水和3 mL DPPH 自由基反应液的吸光度；Ai表示2 mL 样品和3 mL DPPH 自由基反应液的吸光度；Aj表示2 mL 样品和3 mL 无水乙醇的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1料液比对黄酮提取率的影响

由图2可知，料液比(g/mL)在1∶10～1∶20时，核桃青皮中黄酮随着溶剂提取量的增加提取率逐渐减小，料液比(g/mL)在1∶20～1∶30提取率逐渐增高，料液比(g/mL)为1∶30时提取率达到最大，之后再增加溶剂的量提取率直线下降。溶剂较少时，黄酮提取率较低，可能是由于部分黄酮未被浸取出来。随着溶剂的量不断增加，核桃青皮粉末与溶剂的接触面积不断增大，反应充分进行，核桃青皮中黄酮溶出较多。当料液比(g/mL)为1∶30，继续增加溶剂的量，色素和杂质的溶出率增加，而对黄酮的提取率并没有明显增加。因此，提取核桃青皮中黄酮的料液比(g/mL)的最佳条件为1∶30。

图2 料液比的确定

2.1.2浸取时间对黄酮提取率的影响

由图3可知，在10～60 min 范围内，核桃青皮总黄酮提取率随着浸取时间的增加呈升高趋势，在40～50 min范围内变化最明显，50 min之后趋于平缓。这表明在浸取时间达到一定值后，在超声波的机械振动和空化的共同作用下，核桃青皮细胞壁的破裂越来越彻底，总黄酮溶出率大大提高；而随着浸取时间的延长，细胞内的其他物质的溶出率也增加，黄酮类物质的损失和氧化也随之增加。因此，提取核桃青皮中黄酮的最佳浸取时间为50 min。

图3 浸取时间的确定

2.1.3超声功率对黄酮提取率的影响

由图4可知，超声功率为200～450 W范围内，核桃青皮中总黄酮的提取率呈现先增大后减小的趋势，在超声功率为400 W时，总黄酮的提取率达到最大值，为7.13%。初步分析其原因可能超声功率过大容易使试验温度出现猛然升高，从而导致部分黄酮类物质分解，同时乙醇容易挥发，从而导致总黄酮的提取率下降。因此。核桃青皮中黄酮的提取超声功率不宜过大，400 W较为适宜。

图4 超声功率的确定

2.1.4超声温度对黄酮提取率的影响

由图5可知，超声温度为30 ℃～ 55 ℃范围内，核桃青皮中总黄酮的提取率呈现先增大后减小的趋势，在超声温度为40 ℃时，总黄酮的提取率达到最大值。这可能是由于温度低于40 ℃时，核桃青皮中的黄酮未被浸取完全，从而导致提取率较低；而温度高于40 ℃时，黄酮类物质易发生氧化从而其结构遭到破坏，导致提取率降低。因此，最佳超声温度为40 ℃。

图5 超声温度的确定

2.1.5乙醇体积分数对黄酮提取率的影响

由图6可知，在40%～50%范围内，乙醇体积分数越大越有利于核桃青皮中黄酮的提取；在50%～90%范围内，乙醇体积分数越大，黄酮的提取率越低。这可能是由于黄酮是一种极性较大的物质，在乙醇体积分数太高或太低的情况下都不利于黄酮的提取，乙醇体积分数小不能很好的浸取核桃青皮中的总黄酮；乙醇体积分数过大，会溶解核桃青皮中其他物质与黄酮发生反应，从而导致黄酮提取率下降。因此，提取核桃青皮黄酮的最佳乙醇体积分数为50%。

图6 乙醇体积分数的确定

2.2 正交实验结果

根据单因素试验结果，分别选择超声功率、浸取时间、料液比及乙醇体积分数作为考察因素，以总黄酮提取率为考察指标，进行L9(34)正交试验，因素水平表见表1，正交试验结果与数据分析见表2。

表1 因素水平表

由表2可知，各因素对核桃青皮黄酮提取率的影响程度为：B>A>D>C，即浸取时间的影响最大，其它因素依次为超声功率、乙醇体积分数、料液比。最佳工艺条件为A3B2C3D2，即为超声功率为450 W、浸取时间40 min、料液比(g/mL)为1∶35、乙醇体积分数为50%。

2.3 验证实验

为了证实最佳工艺条件下黄酮的提取率的重现性，在最佳工艺条件下做了3组平行实验，测得核桃青皮总黄酮的提取率分别为：7.32%、7.33%和7.31%，平均提取率为7.32%，比正交实验中的最大提取率7.30%高。因此，超声波辅助提取核桃青皮黄酮的最佳工艺条件为：超声功率为450 W、浸取时间40 min、料液比(g/mL)为1∶35、乙醇体积分数为50%。

2.4 体外抗氧化试验

2.4.1核桃青皮黄酮对羟基自由基清除能力的测定

以Vc作为对照，分析了核桃青皮总黄酮对·OH的清除能力[16]，测定结果见图7。由图7可知，核桃青皮总黄酮的质量浓度在0.10～0.50 mg/mL范围内，其对·OH的清除能力随浓度的增加而增强。在检测浓度范围内，核桃青皮总黄酮对·OH的清除能力高于Vc。当核桃青皮中总黄酮浓度达到0.50 mg/mL时，黄酮对羟基自由基的清除率为66.00%，Vc对羟基自由基的清率为65.45%，两者非常接近。核桃青皮总黄酮在0.10 ～ 0.50 mg/mL浓度范围内，对·OH的清除能力强于Vc，具有良好的抗氧化能力。

图7 核桃青皮中黄酮与VC对·OH 清除作用

2.4.2核桃青皮黄酮对DPPH自由基清除能力的测定

以Vc作为对照，分析了核桃青皮总黄酮对DPPH自由基的清除能力，测定结果见图8。由图8可知，核桃青皮总黄酮的质量浓度在0.01～0.05 mg/mL范围内，其对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加迅速增强。核桃青皮总黄酮浓度从0.01 mg/mL增加到0.05 mg/mL时，其对DPPH自由基的清除率从34.73%上升到89.86%，高于同浓度下Vc对DPPH自由基的清除能力，具有较强的抗氧化能力。

图8 核桃青皮中黄酮与VC对DPPH自由基清除作用

3 结论

本文对超声波辅助法提取核桃青皮中黄酮影响因素的单因素实验和正交实验进行了分析。正交实验显示四种主要因素对核桃青皮黄酮提取率的影响大小为：浸取时间>超声功率>乙醇体积分数>料液比。超声波辅助法提取核桃青皮黄酮的最佳工艺条件为：浸取时间40 min、乙醇体积分数50%、料液比(g/mL)1∶35、超声功率450 W，最佳工艺条件下核桃青皮中黄酮的提取率为7.32 mg/g。在0.10～0.50 mg/mL浓度范围内，核桃青皮总中黄酮对·OH的清除能力明显高于Vc；在0.01～0.05 mg/mL浓度范围内，其对DPPH自由基的清除率高于同浓度下Vc对DPPH自由基的清除能力，核桃青皮总黄酮具有良好的抗氧化能力，且随浓度增加，其抗氧化能力增强。通过对核桃青皮总黄酮的提取及抗氧化活性的研究，为其在食品化学、药物化学、天然产物化学等领域新型天然抗氧化剂的开发提供了理论依据。