牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7 的克隆和原核表达纯化

付强 郭妍婷 杨莉 史慧君

（新疆农业大学动物医学学院 830052)

牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus,BVDV）属于黄病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒属（Pestivirus），主要感染牛、羊、骆驼等家畜和野生动物[1]，是牛病毒性腹泻-黏膜病（Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease,BVD-MD）的主要病原之一[2]。该病毒感染成年动物后常呈现隐性感染，一般不表现明显的临床症状，而幼畜感染后常造成腹泻、高烧、白细胞减少、黏膜糜烂甚至脱落等症状，感染孕畜后造成流产、产死胎和畸形胎、繁殖障碍等[3,4]。尤其是非致细胞病变型（Non-cytopathogenic Effect,NCP）BVDV 感染妊娠早期母畜，造成持续性感染（Persistent Infection,PI）犊牛的出现，PI 犊牛一旦再次感染CP 型BVDV 后表现出严重的腹泻黏膜病，最终因脱水和代谢性酸中毒等致死率高达90%，而且PI 犊牛始终向外排毒，成为污染整个牛群的重要传染源[5,6]。

BVDV 非结构p7 蛋白在病毒复制过程中起到重要的作用。有研究报道，非结构蛋白p7 翻译后折叠并加工成六聚体形式，转运至细胞膜上，组成离子孔道，所以p7 蛋白属于离子孔道蛋白家族，主要参与介导一些离子（Na+、Ca2+、K+、H+等）运输，而且对病毒进入细胞及子代病毒在细胞中成熟产生影响[7-9]。本研究开展BVDV 非结构蛋白p7 的基因克隆及原核表达纯化，以期获得p7 蛋白，为后续构建p7 的多克隆和单克隆抗体提供重要的材料和平台。

1 材料和方法

1.1 细菌、载体和cDNA

BL21（DE3）PLySs 大肠杆菌感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司；pCold-MBP 载体购自武汉淼灵生物科技有限公司；BVDV 毒株NADL 的cDNA 保存于新疆农业大学动物医学学院动物病毒实验室。

1.2 主要试剂和仪器

考马斯亮蓝快速染色液、透析袋和5×蛋白上样缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；Kpn I 和BamH I 购自NEB 公司；Taq PCR Mastermix、T4 Ligase、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒和普通质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；Ni-TED 琼脂糖树脂、NaH2PO4、NaCl、咪唑imidazole、琼脂糖和异丙基-b-D-硫代半乳糖苷IPTG 购自生工生物工程（上海）股份有限公司；低温高速台式离心机Micro 21R 购自美国Thermo 公司；C1000 PCR 仪购自美国BioRad 公司；DYCP-31DN型核酸琼脂糖水平电泳仪购自北京六一生物科技有限公司。

1.3 p7 基因克隆及测序分析

根据GenBank 数据库中BVDV NADL（NC_001461.1）基因组序列中p7 基因，设计扩增p7 基因引物为p7-F：5’CGGggtaccATGTCCCAGTATGGGGCAGGTG 3’；p7-R：5’ CG CggatccAGCCT TTGCCATCCCTCCAAC 3’，其中ggtacc 和ggatcc分别为Kpn I 和BamH I 酶切位点。以BVDV NADL cDNA 为模版，以p7-F 和p7-R 为引物，PCR 扩增p7 基因，PCR 反应体系见表1，PCR 反应条件为95℃5min；95℃30s、60℃30s、72℃30s，35 个循环；72℃10min；4℃∞。使用琼脂糖凝胶电泳检测PCR 结果，并使用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒回收p7 基因，将p7 基因送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序分析。

表1 PCR 反应体系

1.4 pCold-MBP-p7 原核表达载体构建

使用Kpn I 和BamH I 对p7 基因和pCold-MBP 质粒进行酶切，酶切体系见表2，酶切反应条件为37℃4 h。酶切反应完成后使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，并使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒将酶切后的p7 基因和pCold-MBP 载体回收，使用T4 DNA Ligase 将p7 基因和pCold-MBP 载体连接，连接反应条件见表3，连接反应条件为16℃过夜；将连接产物热激转化至BL21（DE3）PLySs 大肠杆菌感受态细胞，涂布到含有氨苄西林的琼脂平板中，37℃培养过夜，次日使用PCR 鉴定单克隆菌落，并将阳性克隆送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序鉴定。

表2 酶切反应体系

表3 连接反应体系

1.5 IPTG 诱导条件优化

将pCold-MBP-p7 单克隆菌落接种至LB 肉汤培养基中扩繁，扩繁完成后以体积比1：100 比例接种至新的LB 肉汤培养基中，置于37℃200rpm 振荡培养，待OD600 nm 为0.4～0.6时，分别加入终浓度0、0.6、0.8、1.0、1.2 mM IPTG，16℃条件下200rpm 振荡过夜诱导表达；次日分别取1ml 培养物，8000rpm 离心5min 后弃掉上清，加入100μL 1×蛋白上样缓冲液，使用SDS-PAGE 电泳分离蛋白质，并使用考马斯亮蓝染色套装（染色液+脱色液）进行染色和脱色，具体染色和脱色步骤见试剂盒说明书。

1.6 pCold-MBP-p7 原核表达载体诱导表达和纯化

pCold-MBP-p7 单克隆菌落扩繁步骤同上，扩繁后以体积比1：100 比例接种菌液至新的LB 肉汤培养基中，置于37℃200rpm 振荡培养，待OD600nm为0.4～0.6 时，加入终浓度为1.2 mM IPTG，置于16℃低温过夜诱导表达，次日离心收集菌体沉淀，加入10ml 裂解液（50 mM NaH2PO4，500mM NaCl，20mM imidazole，调节pH 至8.0）重悬沉淀，使用细胞超声破碎仪（15s ON，15s OFF）进行超声破碎至液体清亮。8,000rpm 离心10min 去除细胞碎片，填加到Ni-TED 琼脂糖树脂中，4℃孵育4h 后使用3 倍柱体积的洗涤缓冲液（50mM NaH2PO4，500mM NaCl，40mM imidazole，调节pH 至8.0）进行洗涤，加入洗脱缓冲液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole，调节pH 至8.0）进行4 次洗脱，收集洗脱溶液，进行SDS-PAGE电泳并使用考马斯亮蓝溶液染色进行观察。

1.7 蛋白透析及检测

将透析袋裁剪成适当长度，置于2% NaHCO3和1mM EDTA 溶液中煮沸10min；使用蒸馏水清晰透析袋后，使用1mM EDTA 溶液煮沸透析袋10min，待冷却后灌装洗脱蛋白溶液，置于100 倍体积的磷酸盐缓冲液（20mM，pH 7.0）放置于4℃下渗透过夜，次日转移剩余蛋白溶液至15ml 离心管，取少量蛋白溶液进行SDS-PAGE 电泳，使用考马斯亮蓝溶液染色进行观察，其余置于-80℃为后续使用。

2 结果

2.1 p7 基因扩增及pCold-MBP-p7 原核表达载体构建

以BVDV NADL cDNA 为模版，使用PCR 扩增p7 基因。如图1 所示，PCR 产物大小约为225bp，与p7 基因大小一致；将p7 基因克隆至pCold-MBP 载体后，获得pCold-MBP-p7 原核表达载体，质粒图谱见图2。

图1 PCR 扩增p7 基因结果

图2 pCold-MBP-p7 原核表达载体图谱

2.2 IPTG 诱导条件优化

加入不同浓度的IPTG 后低温过夜诱导，次日收集菌体并使用SDS-PAGE 进行检测。结果如图3 所示，使用1.2mM IPTG 诱导后能蛋白表达量最高，所以后续试验使用1.2mM IPTG 作为诱导条件。

图3 IPTG 诱导浓度优化

2.3 pCold-MBP-p7 原核表达和蛋白纯化

使用IPTG 诱导pCold-MBP-p7 表达过夜，收集菌体后破碎，使用Ni-TED 琼脂糖树脂进行纯化。结果如图4 所示，MBP-p7 融合蛋白成功表达，约49kDa；经过4 次洗脱液洗脱后大部蛋白已从琼脂糖树脂洗脱下来，得到杂带较少的MBPp7 融合蛋白。

图4 MBP-p7 蛋白纯化

2.4 MBP-p7 蛋白透析

使用透析袋对MBP-p7 蛋白进行透析，完成后使用SDS-PAGE进行电泳，使用考马斯亮蓝染色进行鉴定。结果如图5 所示，透析后MBP-p7 蛋白条带较为单一，表明MBP-p7 蛋白纯度高。

图5 MBP-p7 蛋白透析后鉴定

3 讨论

黄病毒科非结构蛋白p7 经翻译后加工聚集并转运至细胞膜上形成六聚体离子孔道形式，参与到离子跨膜运输、病毒侵入和释放等过程，对病毒复制起到重要作用[10]。而目前关于p7 蛋白如何进行聚集，在什么时间p7 蛋白开始聚集尚不清楚，本课题组正在开展BVDV p7 形成离子孔道的机制研究，而目前尚未见BVDV p7 蛋白相关的抗体销售，开展本试验表达纯化p7 蛋白，拟为后续p7 蛋白的多克隆抗体及单克隆抗体研发提供重要的材料。

本试验使用pCold-MBP 原核表达载体进行诱导表达纯化，其中pCold 属于冷休克基因CSPA 启动子，在较低温度下即可诱导蛋白表达，进而降低蛋白诱导过程中因温度过高造成的蛋白聚集、变性、形成难溶物等情况发生[11]；MBP 蛋白标签是一种麦芽糖结合蛋白标签，分子量约42.5 kDa，一般情况下将MBP 蛋白融合在目的蛋白的N 端，有利于减少目的蛋白的降解，提高蛋白的可溶性，维持蛋白结构稳定性，减少纯化难度[12]。本试验使用pCold 实现低温高效诱导表达，使用MBP 蛋白标签实现维持蛋白稳定性的作用。