葡萄柚皮精油抗氧化性和抑菌活性研究

◎ 吕田华，李苗苗，杨英男，王 琳，刘 阳，姚冰钰，李 黎，杜丽霞，应小川

（1.天津天狮学院，天津 301700；2.天津市韵尼科技有限公司，天津 300000）

葡萄柚又名西柚，是一种芸香科柑橘，属小乔木，原产于美国，现在我国南方各省均有栽培[1]。柚皮占整个柚子的43%～48%，含有水分、维生素、矿物质、黄酮类物质、精油和纤维素等，柚皮精油具有祛痰、止咳、去除自由基、抗菌等作用。但柚皮常作为垃圾处理，不仅浪费而且对环境造成污染，因此，对柚皮综合利用给社会产生经济效益[2]。

本实验为了准确评价葡萄柚皮精油清除DPPH自由基的能力[3]，测定葡萄柚皮精油与DPPH自由基反应平衡时所需的时间；以IC50为评价指标测定不同浓度下，葡萄柚皮精油对DPPH自由基清除率的影响；研究了葡萄柚皮精油对革兰氏阳性菌枯草杆菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑菌作用[4-6]，为葡萄柚皮精油工厂化提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄柚：市售；菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，均由天津天狮学院生物与食品工程学院实验室提供。

1.2 主要试剂及设备

DPPH（分析纯）：北京路桥技术股份有限公司；BHT试剂、乙醇溶液均为分析纯：国药集团有限公司；琼脂粉、蛋白胨、酵母浸膏（均为生化试剂）：科泰生物制品有限公司。

XJA-110A高速粉碎机、恒温培养箱、数显式恒温水浴锅、磁力搅拌加热电热套、PL403电子天平、UV紫外可见分光光度计、电热恒温鼓风干燥箱、TD5K-Ⅲ低速离心机、SW-CJ-2D超净工作台。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄柚皮精油的提取

采用水蒸气蒸馏法提取葡萄柚皮精油：将新鲜的葡萄柚皮清洗、晾干、切成4 mm×4 mm大小的块状，置于蒸馏烧瓶中，以料液比1∶20加入蒸馏水，100 ℃，蒸馏提取2 h，直至无油状物质馏出，用无水硫酸钠吸附精油中的水分，密封，置于冰箱中备用。

1.3.2 葡萄柚皮精油提取率测定

准确称取已前处理的新鲜葡萄柚皮，按1.3.1方法提取出葡萄柚皮精油，按照公式（1）计算葡萄柚皮精油提取率：

1.3.3 葡萄柚皮精油DPPH自由基清除率的测定

（1）溶液配制。①DPPH溶液配制。精确称取DPPH粉末，用70%乙醇完全溶解，摇匀，定容，配制成0.06 mol·L-1的DPPH溶液，得到DPPH贮备液，置于冰箱中冷藏备用。②BHT溶液。准确称量BHT粉末8 mg，用溶解，摇匀，定容，配制成质量浓度为80 mg·L-1的BHT溶液，冷藏备用。

（2）不同反应时间对DPPH自由基清除能力的影响。为测定葡萄柚皮精油对DPPH自由基随时间的变化规律，分别选用20 μL和60 μL葡萄柚皮精进行测试。向已知试管中分别加入20 μL和60 μL葡萄柚皮精油，DPPH溶液0.6 mL，再加70%乙醇至0.3 mL，摇匀，每隔2 min在波长515 nm下测定吸光度，记录吸光度值；用同样的方法，向试管中加入DPPH溶液0.6 mL，BHT溶液100 μL，蒸馏水900 μL，摇匀，每隔2min在波长515 nm下测定吸光度，记录吸光度值。

（3）葡萄柚皮精油对DPPH自由基清除率的测定。向试管中加入0.6 mL DPPH溶液和0.3 mL葡萄柚皮精油，用0.1 mL70%乙醇，摇匀，避光反应1 h后，在515 nm处测定A1值。以0.4 mL 70%乙醇溶液、0.6 mL 0.06 mol·L-1DPPH溶液反应后为空白对照A0，利用公式（2）计算DPPH自由基清除率，并绘制葡萄柚皮精油、BHT与DPPH自由基清除率工作曲线，计算半数清除率IC50值。

1.3.4 葡萄柚皮精油抑菌活性研究

（1）菌悬液的制备。将大肠细菌、枯草杆菌菌种接种于琼脂斜面后，37 ℃，培养至对数生长期，用无菌水，挑选单个菌落进，培养24 h制作菌悬液，菌液浓度约为1.5×108CFU·mL-1，冷藏保存。

（2）培养基的制备。①LB液体培养基。胰蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化钠10 g，加入定量蒸馏水，调培养基使培养基pH达到7.0，用蒸馏水定容至1 L。121 ℃灭菌20 min。②PDA培养基。采用文献[7]的方法。

（3）葡萄柚皮精油抑菌能力的测定方法。本实验采用牛津杯法。移取0.1mL不同菌悬浮液，涂布于相应的无菌平板上。将已灭菌的无菌牛津杯（直径为8.0 mm），分别加入70%乙醇0.2 mL，向另外两个中滴加5 μL葡萄柚皮精油，置于37 ℃、培养24 h，测定抑菌圈直径，每个菌种重复5次。测得抑菌圈直径越大，表示其抑菌活性越强。

（4）葡萄柚柚皮精油抑菌圈直径试验判定标准。抑菌圈直径＜7 mm为不敏感；抑菌圈直径7～9 mm为低度敏感；抑菌圈直径10～14 mm为中度敏感；抑菌圈直径15～20 mm为高度敏感；抑菌圈直径＞20 mm为极度敏感。

（5）测定菌株的最小抑菌浓度。本实验采用试管二倍稀释法[8]在5个灭菌试管中分别加入LB培养液3 mL，取第1支试管加入精油原液3 mL，混匀后吸取3 mL加入第2支试管，重复操作，直至第5支试管抽取3 mL废弃，在这5支试管加入待测菌悬液0.1 mL。另设一管为LB培养液对照组，一管为葡萄柚皮精油为对照组，细菌置37 ℃恒温培养18 h，以不出现浑浊的最高稀释倍数为最小抑菌浓度（MIC）。

2 结果与分析

2.1 不同反应时间对DPPH自由基清除率的影响

溶液吸光度随时间变化如图1所示。由图1可知，BHT清除DPPH自由基速度比葡萄柚皮精油清除DPPH自由基速度较快，10 min后BHT清除DPPH自由基反应达到平衡，为快速抗氧化剂，加入20 μL和60 μL柚皮精油清除DPPH自由基反应随着时间的延长反应速度缓慢，得出葡萄柚皮精油为慢速抗氧化剂。由于BHT对DPPH自由基清除时间10 min达到平衡，而葡萄柚皮精油对DPPH自由基清除时间60 min达到平衡，为了与精油做对比性试验，综合选择60 min反应时间为测定清除DPPH自由基的反应时间。

图1 溶液吸光度随时间变化曲线图

2.2 葡萄柚皮精油对DPPH自由基清除率的测定

葡萄柚皮精油对DPPH自由基的清除率如图2所示。由图2可知，随着葡萄柚皮精油添加量的增加，DPPH自由基清除率逐渐增大，当添加量为250 μL时，DPPH自由基清除率变化趋于平缓。由图3可知，随着BHT添加量的增加，DPPH自由基清除率逐渐增大，当添加量为120 μL时，DPPH自由基清除率变化趋于平缓。

图2 葡萄柚皮精油对DPPH自由基的清除率曲线图

图3 BHT溶液对DPPH自由基的清除率曲线图

根据图2、图3，葡萄柚皮精油、BHT的回归方程与半数清除率见表1。由表1可得，葡萄柚皮精油清除DPPH自由基的IC50为160.81 μL，BHT溶液清除DPPH自由基清除的IC50为88.31 μL，通过半数清除率的比较，BHT溶液的清除能力较强，葡萄柚皮精油也具有清除DPPH自由基的能力，但与人工合成的抗氧化剂BHT清除自由基能力上存在差距。

表1 精油、BHT回归方程与半数清除率表

2.3 葡萄柚皮精油的抑菌性

葡萄柚皮精油对大肠杆菌与枯草杆菌的抑菌效果见图4。葡萄柚皮精油对大肠杆菌和枯草杆菌得的抑菌圈直径测定为（11.4±0.32）mm和（15.2±0.18）mm。在相同条件下，葡萄柚皮精油对大肠杆菌的抑菌活性比葡萄柚皮精油对枯草杆菌的抑菌活性更强，葡萄柚皮精油对大肠杆菌属于中敏感度，对枯草杆菌属于高敏感度，本结果与钱骅等人[9]的研究结论相同，实验表明葡萄柚皮精油对大肠杆菌和枯草杆菌均有抑制作用。

图4 葡萄柚精油对大肠杆菌与枯草杆菌的抑菌圈图

2.4 葡萄柚皮精油对不同菌种的最小抑菌浓度（MIC）

MIC的高低能反映出葡萄柚皮精油对不同菌种的抑菌效力，MIC越高，抑菌效果就越弱，反之，抑菌效果就越强，由表2可知葡萄柚皮精油对不同菌种的最小抑菌浓度，测定结果与牛津杯法结果一致。

表2 葡萄柚皮精油对不同菌种的最小抑菌浓度表

3 结论

（1）通过测定不同反应时间对DPPH自由基清除率的影响，试验得出在60 min左右葡萄柚皮精油对DPPH自由基清除反应达平衡。

（2）以BHT为对照，得到葡萄柚皮精油具有清除DPPH自由基的能力。

（3）葡萄柚皮精油对革兰氏阳性菌枯草杆菌、阴性菌大肠杆菌都有抑菌效果。枯草杆菌抑菌效果为高度敏感。

（4）葡萄柚皮精油对枯草杆菌的最小抑菌浓度为 7.31 mg·mL-1；大肠杆菌其次，为 10.92 mg·mL-1；测定结果与牛津杯法测定出的一致。

本实验通过从葡萄柚皮中提取精油，不仅可使葡萄柚原料综合利用率提高，增加葡萄柚产品的附加值以及经济效益，同时还可减少对环境的污染。