酶法提取多糖的研究进展

董 宇,林翰清,缪 松,3,*,卢 旭,*

(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002; 2.中国-爱尔兰国际合作食品物质学与结构设计研究中心,福建福州 350002; 3.爱尔兰农业部农业与食品发展局Teagasc食品研究中心,爱尔兰科克 999014)

多糖类化合物是重要的天然产物资源,在自然界中分布极广。多糖是动植物细胞壁的组成成分,如肽聚糖和纤维素;多糖也可作为动植物储能物质,如糖原和淀粉;此外多糖还具有特殊的生物活性,如肝素在人体内具有抗凝血作用,肺炎球菌细胞壁中的多糖具有抗原作用,因而这类多糖被称为活性多糖。目前的研究表明,活性多糖具有多种生物活性,尤其是其具有免疫调节、抗癌、抗病毒、降血糖等功能,近年来已经成为食品、医药以及生物领域的热点[1-3]。多糖提取和分析方法也发展迅猛,目前多糖的提取方法主要有酸碱提取法、超声提取法、微波提取法、超临界萃取法、酶提取法、超高压提取法、动态高压微射流技术、高压脉冲电场提取技术(High intensity pulsed electric fields,HIPEF)以及多种方法互相结合的联合提取法[4-7]。众多的提取方法一般以水作为提取溶剂;酸碱提取法工艺要求严格,如果超出工艺要求的酸碱度范围可能引起多糖中糖苷键的断裂;超声、微波、高压提取法对多糖的组成和活性有较大的影响;酶法提取相对于其他提取方法,具有反应条件温和、产物不易变质、提取效率高、成本低、环保节能、优化有效组分等显著的优势[4-5,8],尤其是酶法与其他提取方法相结合的辅助提取方法,可提高提取效率,并减少提取时间。因此,本文主要阐述了多糖类化合物酶法提取技术的原理、特点及影响因素,并广泛比较了该技术的应用进展,由此对该技术的发展进行了展望。

1 酶法提取多糖的原理及其影响因素

1.1 酶法提取多糖的原理

酶法提取多糖的原理在于酶的特异性催化作用,且与酶作用于底物化学键位的选择性有关。酶可以选择并针对性地降解植物、藻类以及微生物的细胞壁和细胞膜(如淀粉、纤维素和果胶等主要细胞成分),减少溶剂提取时来自细胞壁、细胞膜和细胞间质的阻力,使有效成分得到释放[9-12],同时酶的使用也可将部分多糖降解为更小分子量的片段,从而更有利于多糖从细胞内分离出来[13]。酶法提取多糖常见的酶有纤维素酶、果胶酶、蛋白酶,具体使用种类要根据不同的底物而定。例如植物的细胞壁成分是由纤维素、半纤维素、果胶质、木质素等物质构成,则一般需要纤维素酶和果胶酶;而动物细胞膜一般由脂质与蛋白质构成,一般由蛋白酶水解,例如星虫科的方格星虫,肉质脆嫩,含有丰富的蛋白质多糖复合物类活性物质,需要采用胰蛋白酶进行酶解[14-15]。

1.2 酶法提取多糖的影响因素

酶法提取多糖的效率一般与温度、pH、底物浓度、酶浓度、提取时间、抑制剂及激活剂等因素相关,通过预试验一般可以获得相关因素的酶解最适条件。

1.2.1 温度和pH 每一种酶都有一个最适的温度范围,但它不是固定的,其大小受作用时间、底物种类等影响,并且过高或过低的温度都会降低酶解效率。同样过高或过低的pH也会造成酶解效率的下降,原因是pH的不适会引起酶蛋白质构象的改变,从而导致了酶的变性;即使pH的不适未引起酶的变性,但其同样会影响酶与底物的解离过程,从而降低酶活性,不利于催化产物的形成。此外,酶构象的活性位点或官能团区域可能会因为pH的调节而改变[16]。

1.2.2 底物浓度与酶浓度 当底物过量时,反应达到平衡后,酶解效率不会因为底物浓度的增加而增加;而酶解时间会因为酶的不足而延长,当加酶量过多时,底物的稀缺会造成酶与酶之间出现竞争底物的现象,从而抑制酶的催化作用,同时也会造成酶的浪费。

1.2.3 提取时间 酶提取多糖时间的长短也会影响催化效率,当酶解时间过短时,酶与底物的反应会不充分,从而导致产物的提取率较低;当酶解时间过长时,酶促反应完成后,产物提取率不会随着时间的延长而增加,当酶足量时,随着酶解时间的延长,多糖甚至会被酶降解为单糖,得率反而下降[17-20]。

1.2.4 抑制剂及激活剂 抑制剂会与酶进行可逆或不可逆的结合,从而抑制酶的催化作用。当酶的活性基团与抑制剂以共价键的形式牢固结合时,酶的活性会丧失,超滤、透析等方法也无法除去抑制剂以恢复酶的活性,此为不可逆结合。可逆结合可分为竞争性抑制作用、非竞争性抑制作用和反竞争性抑制作用。竞争性抑制作用为抑制剂与酶所作用的底物结构相似,可与底物共同竞争酶的活性位点;非竞争性抑制作用为抑制剂与底物可同时结合在酶的不同部位,形成酶-底物-抑制剂三元复合物,使反应终止;反竞争性抑制作用为酶与底物形成络合物后才能与抑制剂结合,结果同样使反应终止。与不可逆结合不同的是,可逆结合可通过物理的方法去除抑制剂,并恢复酶活性。酶的激活剂大多都是金属离子或者其他无机离子,某些还原剂也能激活特定的酶,使酶中二硫键还原成巯基从而提高酶活性;但激活剂也有其最适浓度,过多也会造成对酶的抑制作用[21]。

2 酶法提取多糖的技术

目前酶法提取多糖的技术主要有单酶法、多酶法、酶法提取技术与其他技术的联用三大类。本文将根据相关研究的最新进展对这几种方法进行介绍和比较。

2.1 单酶法提取

单酶法是指只利用一种酶来酶解原料从而获取多糖的方法,经常使用的酶包括纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等。纤维素酶是一种可以酶解纤维素的β-D-葡萄糖苷键,破坏植物的细胞壁,从而释放出多糖等有效成分的酶。蛋白酶是一种可以水解生物体内游离的蛋白质,使蛋白质的结构变得松散的酶;蛋白酶还可以水解糖蛋白和蛋白聚糖中游离的蛋白质,降低蛋白质对原料的结合力,使得多糖的浸出变得有利[14]。目前多糖提取中常用的蛋白酶有胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶。果胶酶是一种作用于果胶复合物的酶的总称,包括果胶甲酯酶、聚半乳糖醛酸酶和果胶酸裂解酶三种。如表1所示,通过总结可以看出,单一酶提取多糖的条件和得率会随着提取物的不同而表现出较大的差异,相同的多糖水解酶在酶解不同底物时的最适pH和温度仍然表现出了一定的规律性,纤维素酶的最适pH在4.5～6.0,温度在50 ℃左右;胰蛋白酶的最适pH在8.0～8.6,温度在37～60 ℃;中性蛋白酶的最适温度在40～54 ℃;木瓜蛋白酶的最适pH在4～6.6,温度在50～55 ℃;果胶酶的最适pH在3.0～5.0,温度在40～60 ℃。单酶法提取多糖得率与传统热水提取多糖得率相比并没有突出优势,甚至多糖提取率会略低于热水提取,因此单酶法提取不适合用于多糖生产,一般是作为预实验来观察提取效果或者作为多酶法提取正交设计实验的单因素实验来进行研究[22-25]。

表1 不同酶在多糖提取中的应用Table 1 Application of different enzymes in polysaccharide extraction

2.2 多酶法提取

多酶法提取包括复合酶法提取和分段酶法提取,多酶法提取中酶种类的选取一般依据提取物细胞壁、细胞膜的成分或者其多糖与所结合蛋白质的性质。复合酶法提取即选用两种或多种酶,并按照一定比例进行组合优化后,同时作用于提取物,以起到增加酶解效率和多糖提取率的效果。复合酶法的酶配比、加酶量、温度、pH等最优条件的研究一般是在单酶最适条件研究的基础上,通过正交试验或响应面试验等来确定[16,55-56]。夏平等[57]以桑叶多糖为研究对象,以纤维素酶和果胶酶(质量比为1∶1)为复合酶,多糖提取率高达14.32%,是王芳等[58]采用单一纤维素酶(12.49%)法提取率的1.11倍。于翠芳等[59]采用复合酶法(蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶=1∶1∶1)提取枸杞多糖,提取率为13.96%,是吴素萍等[27]采用单一纤维素酶(11.20%)法提取率的1.25倍。张艳等[60]采用复合酶法(纤维素酶∶木瓜蛋白酶=1∶1)提取香菇多糖的提取率高达13.25%,是王文文等[61]采用单一纤维素酶(4.16%)提取法的3.19倍。以上的研究表明,优化后的复合酶法可提高多糖的提取率,但还需优化酶的合理配比以及酶种类组合,如提取洋葱多糖过程中李建凤等[62]采用纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶(较优配比为18∶5∶10)的复合酶法的提取率为3.75%,明显小于陈曦等[63]采用纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶(2∶2∶1)为复合酶的研究(18.75%),也同样小于曹芮等[40]采用胰蛋白酶单酶法的提取率(13.10%)。

分段酶法提取中酶的加入顺序、每种酶的作用时间等都会对提取效果有影响。分段酶法提取中酶的添加顺序一般是通过研究酶的不同加入顺序对多糖提取的效果来确定,同时各酶分段使用的最优条件是在单因素实验研究的基础上通过正交试验或其它试验来获取。王艳等[64]采用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶提取姬松茸多糖,在采用均匀设计法获取各单酶最适条件的基础上进行复合酶法和分段酶法研究,分段酶法研究中酶的添加顺序按照三种酶的排列组合即6种顺序依次研究对多糖提取的效果,结果显示,分段酶法多糖得率均高于复合酶法(11.65%),也高于热水提取法(7.69%);酶的最优添加顺序为先添加果胶酶,然后添加纤维素酶,最后添加木瓜蛋白酶,并且每种酶的作用条件均是其最优条件,最终多糖提取率为13.42%,但通过对比6种添加顺序对多糖得率的影响发现,6种添加顺序所获得的多糖提取率之间并没有太大差别,极差仅为1.29%。程俊文等[65]采用分步酶法,在优化的条件下利用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶分别依次处理了香菇子实体,最终多糖得率达到14.17%,高于张艳等[60]的研究(13.25%)。分段酶法提取多糖优于复合酶的优势在于可以给予每一种酶较优的酶解条件,从而发挥每一种酶的最大作用和效率,避免由于酶解条件的不同对于酶解效率的影响,最大限度地提高提取率,但是该法步骤繁琐,会增加工作量和资本投入,因此需要在实际工作中进行取舍。

2.3 酶法提取技术与其他技术的联用

2.3.1 超声波协同酶法提取多糖 超声波辅助提取法的原理主要是依据超声波的机械效应、空化作用和热效应,通过提高物质的分子运动频率和速度来增加溶剂的穿透力,从而提高被提取成分的溶出速度。超声波和酶法辅助提取是近年来发展起来的从植物中提取生物活性物质的新技术。范金波等[66]以黑木耳为原料,优化了超声波辅助复合酶法对黑木耳多糖的提取工艺,获得超声波复合酶作用时间为66 min时,多糖提取率为22.25%,是钧矛等[67]采用的复合酶法提取率的5.11倍,时间也缩短了122 min;同样王杉杉等[68]以枸杞为原料,优化超声波辅助复合酶法提取枸杞多糖的工艺条件,其中超声时间为50 min,多糖平均得率为58.910%,是于翠芳等[59]采用复合酶法提取率的4.22倍,并且提取时间也缩短了10 min。贯云娜等[69]以大蒜为研究材料,其中比较了复合酶法、超声辅助复合酶法、酶解后超声提取、超声后酶解提取对大蒜多糖得率的影响,研究表明超声辅助复合酶法提取最优提取时间为30 min,大蒜多糖得率为25.798%,是超声法提取的1.21倍,是复合酶法提取的1.48倍,且消耗时间更短,同时酶解后超声提取和超声后酶解提取的得率分别为21.832%和23.199%,因此该文的研究表明,超声波环境并没有影响复合酶的活性,反而通过两者的协同作用增加了大蒜多糖的得率。综上超声波可以通过破坏细胞壁,促进多糖的溶出,进一步提高其产量,同时采用超声辅助提取可以缩短提取时间[70-72];而酶辅助提取具有投资成本低、能耗低、重现性好、操作简便等优点[20,73-74],因此,两种方法的结合可起到互相促进的作用。

2.3.2 微波协同酶法提取多糖 微波是一种具有较高能量的高频电磁波。微波能够以高能量照射植物细胞,可使细胞内部的极性分子产生偶极涡流、离子传导和高频率摩擦等现象,导致细胞内产生大量热量,细胞内温度升高,分子运动速度加快,同时液态水汽化产生水蒸气,进一步导致胞内压力变大,最终导致细胞内部的化学成分冲破细胞壁,释放到提取溶剂中[8,75-76]。王珺等[77]采用微波辅助酶法(α-淀粉酶∶纤维素酶(g/g)=10∶1)提取怀山药多糖,提取率为34.78%,是乔宇等[78]采用单酶法提取的5.72倍。李静等[79]采用微波辅助酶法(纤维素酶与果胶酶比例为1.3∶1)提取柚皮多糖,提取率为22.8%,是王莹等[80]采用复合酶法提取的2.76倍,是岳贤田[81]只采用微波辅助提取法的1.32倍,并且节省微波时间160 min。此外与传统水提取法相比,微波法具有处理量较大、萃取效率高、耗时短、选择性好、萃取效率和产品纯度更高等优点,但微波在提取时间较长的情况下会破坏多糖的结构,降低多糖的活性[82]。因此微波法与酶法联用可以有效地减少微波时间较长对多糖结构的破坏,同时弥补酶法提取的不足。

2.3.3 高压脉冲电场(HIPEF)法协同酶法提取多糖 高压脉冲电场技术是一种已被应用于多糖提取领域的新兴非加热处理技术,该技术目前广受关注,因为该技术具有电穿孔性能,赋予其较强的破除细胞屏障的能力,而且对热敏性物质的破坏力较小,即可最大限度地减少对多糖和酶活性的破坏,同时HIPEF还具有能耗低、操作低、费用低、提取时间短、提取率和得率高、部分提取物在低温下有效性增强、所提生物活性成分稳定性高等优点,因此在多糖生产中具有良好的应用前景[6,83]。陈文等[84]采用酶技术结合高压脉冲电场法优化了方格星虫多糖提取的工艺实验条件,最佳工艺条件中酶解时间为2 h,最大提取率为6.45%,是张琴等[14]人采用胰蛋白酶法提取的4.06倍,同时时间缩短1 h。

3 酶法提取多糖优势

3.1 提取率较高

酶法提取是多糖提取方法中较为成熟有效的一种,尤其是在多糖提取率方面具有突出优势。例如表2中段宙位等[85]、李莹等[86]、邓桂兰[87]和王鹏等[88]的研究表明,与传统的水提法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、以及碱浸提法等方法相比,酶法提取在多糖的提取率方面的效果优于其他方法,尤其是复合酶法的提取效果更加明显。而Chen等[89]、Wu等[90]、Li等[91]和Chen等[92]的研究也表明,超声辅助酶法比酶法、超声辅助提取法和水提法的多糖提取率更高,酶法提取率高的原因在于在最适的反应环境下,酶促反应的高效性和专一性使得多糖的释放效率得到了较大的提升。而酶法与其他方法联用可互补各技术之间的缺陷,进一步提升多糖的提取率。

表2 酶法提取多糖的优势Table2 Advantages of enzymatic extraction of polysaccharides

3.2 生物活性更强

如表2所示,在抗氧化性以及抗癌效果等生物活性方面酶法提取多糖的效果也明显优于其他方法。这可能是由于多糖提取方法和提取条件的不同,造成了所提多糖的分子量大小、单糖含量及其组成有所差别,从而影响了其抗氧化等生物活性。而且研究普遍认为多糖的化学成分、结构、分子质量和构象会影响其生物活性和其他药用特性[93-95]。研究表明,酶法提取多糖与传统的热水提法等方法相比,其多糖的形貌结构、单糖的组成上往往没有明显差别[16,89,96],但是在单糖的比例、多糖的分子量分布和未甲基化半乳糖醛酸的含量上会有差别[90,97-99]。Fan等[100]研究了复合酶法提取的多糖相比于单酶法和水提法所提取的多糖的差异,结果表明多糖分子量与抗氧化性的相关性最强,多糖的分子量越小,抗氧化性越高,而复合酶法提取出的多糖分子量最小,因此其抗氧化性最高。而其他研究也表明了酶法提取多糖可能是通过降低多糖的分子量来增强多糖活性[98-101],此外Wu等[90]和Shang等[99]的研究还表明,酶法提取的多糖中具有抗氧化活性的未甲基化半乳糖醛酸的含量更高。因此酶法提取可通过降低多糖分子量、增加提取物中未甲基化半乳糖醛酸的含量来改变多糖的生物学活性,其原因可能是酶法提取所获得的多糖,打破了原生多糖的长链结构,从而释放了更多的活性单元,并且未破坏其活性单元的聚合结构,使其相对分子质量保持在一个合适的较低水平,从而在整体上提升了多糖的活性。

此外,采用超声辅助提取法和微波辅助法提取的多糖在抗氧化性上也会高于传统水提法[101-102],研究表明这也可能是通过降低多糖的分子量和增加去甲基糖醛酸而增加了多糖的活性[103-106],因此采用微波辅助酶法或者超声辅助酶法提取多糖可能是一种更好的选择。例如,Chen等[89]采用热水提取法、超声辅助提取法、酶辅助提取法和超声辅助酶法提取山楂多糖,热水提取法获得的多糖相对分子质量最大,其他方法获得的多糖相对分子质量无明显差异;超声辅助酶法获得的多糖对超氧自由基的清除作用最强。Li等[91]、Wu等[90]和Chen等[92]的研究同样也表明相比于热水提取法、酶法和超声辅助提取法,超声辅助酶法提取的多糖抗氧化性最好,并且其多糖的分子量最低、糖醛酸或者熊果酸的含量最高。

4 结论及展望

酶法提取多糖技术由于具有酶促反应条件温和、高效、环保、节能和特异性强等优点,得到了广泛的应用。目前,随着人们对于活性多糖功能的研究越来越多,酶法提取技术也得到了不断地发展,近年来的研究表明单一酶法提取技术的应用越来越少,复合酶法以及复合酶法结合超声辅助提取技术的应用越来越多,这一改变与所获多糖的提取率和活性较高直接相关。高压脉冲电场技术作为一种新兴的多糖提取技术,其与酶法的结合已经在方格星虫多糖提取中得到应用,该技术在一定功率下具有产热少、耗能低的优点,明显优于超声波及微波等技术,相信该技术与酶法的结合使用将会成为未来多糖提取的一个热点研究方向。此外,多糖的提取技术服务于多糖的活性功能研究已经成为目前多糖提取技术发展的基本理念,即以“生理功能-有效组分-提取工艺”为核心的研究思路,将有效多糖组分的产率设为优先指标,提取环节就进行方法的选择和优化,可大大增加功能多糖的生产效率,减少不必要的资本消耗。酶法提取的多糖具有更好的生物学活性,在未来相关领域的发展中将会扮演更为重要的角色。