血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达水平在乳腺癌诊断中的应用价值

吴衍，高文玉，高苏平，李志红

（上海健康医学院附属周浦医院 普通外科，上海 200135）

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，其发病率位居中国女性恶性肿瘤首位[1]。但乳腺癌往往起病隐匿，早期缺乏特异性表现，临床主要通过乳腺彩超和钼靶进行初步筛查，进而借助病理细胞学检查明确诊断，但这些方法往往导致患者错过早期诊治的重要时机[2]。微小RNA（miRNA）是一种由18～24个核苷酸组成的非编码蛋白RNA小分子[3-4]，通过对靶基因的翻译抑制或切割降解来调控基因的表达，其与多种肿瘤的发生发展有关，并有研究发现某些miRNA的异常表达与乳腺癌的不良预后有关[5-6]。通过检测多种miRNA在乳腺癌细胞株中表达的相关研究显示，miR-196a-5p呈显著高表达[7-8]，而miR-339-5p表达显著下调[9]。因此，两者的生物学功能可能对乳腺癌诊断有着重要临床意义，本研究联合检测乳腺癌患者血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达水平，观察其在乳腺癌早期诊断中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2016年1月—2017年6月在我院就诊的乳腺外科诊治的乳腺癌患者107例（乳腺癌组），年龄35～79岁，平均（51.28±9.65）岁；根据TNM分期标准：I期34例，II期37例，III期21例，IV期15例；病理为浸润性导管癌72例，黏液腺癌7例，导管内癌8例，小叶癌8例，髓样癌12例。纳入标准：均被病理确诊乳腺癌，女性；术前无放化疗和内分泌治疗；均接受乳腺癌的手术治疗；所有患者临床病理资料完整；无其他肿瘤病史。选择同期在我院诊断为乳腺良性疾病的患者60例（乳腺良性疾病组），年龄35～79岁，平均（52.19±10.58）岁；其中乳腺病33例，乳腺导管内乳头状瘤11例，乳腺不典型增生7例和乳腺纤维瘤9例。选择同期在我院行健康体检者35 例（健康对照组），年龄35～79岁，平均（51.76±9.75）岁。所有的患者均知情同意，并签署知情同意书和经医院伦理委员会审核通过。3组在年龄等基线资料具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 血液标本留取患者各组入院后和乳腺癌手术后1 周抽取肘静脉血10 mL。采用离心机将血液离心，离心半径15 cm，离心速度3000r/min，离心15 min，抽取上清液放置在除酶管内，放置在-70 ℃冰箱中保存。

1.2.2 qRT-PCR总RNA 抽取：采用受试者血清400 µL，采用TRIzol 试剂盒进行提取血清总RNA，反转录引物有上海化生有限公司合成，miR-196a-5p 上游引物序列：5'-CGCGCGTAGGTAGTTCATGTT-3'，下游引物序列：5'-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'；miR-339-5p 上游引物序列为：5'-GGGTCCCTGTCCTCCCCA-3'，下游引物序列5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'。U6 的上游引物为：5'-GAGGCACAGCGGAACG-3'，下游引物：5'-CTACCACATAGTCCAGG-3'。miRNA 的检测：选择反转录酶1 µL，RNA5 µL和3 µL 引物，在15 µL 的反应体系中，采用美国ABITaqMan PreAmp Master Mix 进行扩增，扩增条件为：在16 ℃ 30 min，42 ℃反应30 min 和85 ℃反应5 min。取反转录配制20 µL 反应体系，放置在荧光定量仪中进行反应，反应条件为：95 ℃预变性为15 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，连续40 个循环。每个样品检测3 次，以2-ΔΔCt表示。

1.2.3 观察指标比较各组血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和乳腺癌特异性标志物CA15-3 水平，三者诊断乳腺癌的效能，以及血清miR-196a-5p和miR-339-5p 表达水平与临床病理特征的关系。

1.3 统计学处理

采用SPSS15.0统计分析软件对数据进行分析，呈正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）进行表示，多组独立因素的计量资料采用方差分析，两组独立因素的计量资料采用t检验。采用Logistic二元回归分析得出血清mi R-196 a-5p和miR-339-5p联合变量，绘制出受试者曲线（ROC）评价诊断乳腺癌的效能。采用MedCalc软件计算截断值。检验水准，α=0.05。

2 结果

2.1 各组血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3水平比较

乳腺癌组血清miR-196a-5p表达水平明显高于乳腺良性疾病组和健康对照组（P<0.01），乳腺良性疾病组明显高于健康对照组（P<0.01）；乳腺癌组血清miR-339-5p表达水平明显低于乳腺良性疾病组和健康对照组（P<0.01），乳腺良性疾病组明显低于健康对照组（P<0.01）；乳腺癌患者血清CA15-3水平明显高于乳腺良性疾病组和健康对照组（P<0.01），而乳腺良性疾病组和健康对照组差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。

表1 各组血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 水平比较（±s）Table 1 Comparison of the serum levels of miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 among groups(±s)

表1 各组血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 水平比较（±s）Table 1 Comparison of the serum levels of miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 among groups(±s)

注：1）与健康对照组比较，P<0.01；2）与乳腺良性疾病组比较，P<0.01Note:1)P<0.01 vs.healthy control group;2)P<0.01 vs.benign breast disease group

组别miR-196a-5p（2-△△Ct） miR-339-5p（2-△△Ct）CA15-3（kU/L）健康对照组（n=35）1.52±0.763.12±0.9212.96±5.28乳腺良性疾病组（n=60）2.75±1.071)1.49±0.521)14.77±10.20乳腺癌组（n=105）4.84±1.601),2)0.81±0.381),2)25.10±11.251),2)F 119.680291.44134.393 P 0.0000.0000.000

2.2 血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达水平在诊断乳腺癌的效能

血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达的诊断乳腺癌的效能明显优于血清CA15-3（Z=2.543，P<0.05；Z=2.190，P<0.05），而血清miR-196a-5p表达与miR-339-5 p 之间差异无统计学意义（P>0.05），将miR-196a-5p和miR-339-5p指标进行二元Logistic回归得方程y=1.09×xmiR-196a-5p-3.61×xmiR-339-5p+0.66，联合检测（miR-196a-5p+miR-339-5p）的灵敏度为91.6%，特异度为88.3%，其AUC为0.937，明显高于单个指标表达（miR-196a-5p：Z=3.044，P<0.01；miR-339-5p，Z=3.020，P<0.01）（表2）（图1）。

表2 血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 对诊断乳腺癌的诊断效能Table 2 Diagnostic efficiencies of serum miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 for breast cancer

图1 血清miR-196a-5p、miR-339-5p 和CA15-3 在诊断乳腺癌的灵敏度和特异度Figure 1 The sensitivities and specificities of serum miR-196a-5p,miR-339-5p and CA15-3 in diagnosis of breast cancer

2.3 乳腺癌患者术前miR-196a-5p 和miR-339-5p 表达的关系与术后的变化

乳腺癌患者术前血清miR-196a-5p表达与miR-339-5p呈负相关（r=-0.764，P<0.01），手术后乳腺癌患者血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达分为1.86±0.85和2.59±0.86，血清miR-196a-5p表达水平较手术前明显降低（P<0.01），而miR-339-5p表达较术前明显升高（P<0.01）。

2.4 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 表达与临床病理因素的关系

乳腺乳腺癌患者血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达水平与肿瘤直径、淋巴结转移和TNM分期具明显有关（均P<0.01），而与年龄，绝经否，组织学分级，ER，PR和HER-2无明显关系（均P>0.05）（表3）。

表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平与临床病理因素的关系（±s）Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)

表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平与临床病理因素的关系（±s）Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)

因素年龄（岁例数（n）miR-196a-5ptPmiR-339-5ptP）＜50674.84±1.630.0530.9580.81±0.380.0950.924≥50404.83±1.570.82±0.37绝经与否是454.83±1.560.0610.9510.82±0.360.0270.979否624.84±1.640.81±0.39肿瘤直径（cm）＞2576.01±1.0513.1360.0000.53±0.2014.8150.000≤2503.49±0.911.14±0.23组织学分级I295.02±1.490.77±0.35II374.66±1.740.4260.6540.85±0.410.3910.678III414.86±1.570.81±0.37

表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平与临床病理因素的关系（±s）（续）Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)(continued)

表3 乳腺癌患者血清miR-196a-5p 和miR-339-5p 水平与临床病理因素的关系（±s）（续）Table 3 Relations of serum levels of miR-196a-5p and miR-339-5p in breast cancer patients with clinicopathologic factors(±s)(continued)

因素巴结转移例数（n）miR-196a-5ptPmiR-339-5ptP淋有553.54±0.9213.3340.0000.51±0.2014.7190.000无526.07±1.041.13±0.23TNM 分期I343.12±0.881.25±0.19II374.69±0.43106.7420.0000.81±0.10268.5730.000III～IV366.61±0.870.40±0.16ER阳性644.85±1.650.0690.9450.81±0.380.1260.900阴性434.82±1.520.82±0.37PR阳性664.82±1.630.1410.8880.82±0.380.9620.911阴性414.86±1.570.81±0.37HER-2阳性324.98±1.430.6200.5370.78±0.330.6500.517阴性754.77±1.680.83±0.39

3 讨论

miRNA是一类进化上保守的小分子非编码RNA，成熟miRNA通过与mRNA的3'非翻译区（UTR）结合诱导其降解、翻译抑制或从翻译机制中截留靶向mRNA来调控基因的表达[10]。研究[11-12]表明，特定的miRNA在不同的肿瘤中出现明显的上调或下调，可能作为肿瘤预测标志物和潜在的治疗靶点，具有显著的临床价值。miRNA表达具有组织特异性，其表达差异可以区分不同分化类型的肿瘤，也可以区分正常组织和肿瘤组织，临床诊断中可以帮助寻找肿瘤原发病灶[13-14]。现在其已作为某些特定肿瘤的分子诊断学依据，而且其在肿瘤治疗和预后中的作用也受到极大的关注[15-16]。

miR-196a是2004年发现的HOX家族基因转录而来，在细胞分化的调节过程中扮演着重要角色，与肿瘤的发生发展存在重要联系。现有研究显示miR-196a在多种肿瘤表现出类似致癌基因的生物学特性，且降低miR-196a的表达具有明显抑制肿瘤增殖、转移侵袭、促进凋亡甚至有逆转耐药的作用[12,17]。王艳等[9]研究通过miRNA芯片技术检测847种miRNA在不同侵袭力乳腺癌细胞株中的表达，获得与乳腺癌侵袭相关的miRNA表达谱，miR-339-5p表达显著改变，具有类似抑癌基因的生物学特性，并发现miR-339-5p转染到乳腺癌中能够明显抑制乳腺癌的增殖和转移[18]，两者可能成为乳腺癌诊断的重要肿瘤预测标志物。

在一项食管癌的研究证实miR-196a出现高表达，并且发现miR-196a能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移，对与预测肿瘤预后和早期诊断方面具有较高的临床价值[19]。在对胃癌的研究中发现出现miR-196a高表达，并且与肿瘤大小和肿瘤分期呈正相关，与患者的生存期呈负相关[20-21]。miR-196a在结肠癌组织或者细胞系中呈高表达，而高表达的miR-196a可以激活Akt信号通路促进结肠癌的侵袭和迁移能力，并且增强细胞对化疗药物的耐药[22]。本组研究显示乳腺癌组患者血清miR-196a-5p表达水平明显优于乳腺良性疾病组和健康对照组，并且术后血清miR-196a-5p水平出现明显降低，说明血清miR-196a-5p表达来源于乳腺癌细胞。miR-196a-5p在乳腺癌的表达水平研究较少，有研究发现通过转染miR-196a-2到乳腺癌细胞内，会起到类似致癌基因的作用，并认为miR-196a-2可以作为乳腺癌的新型标记物[23]。本组研究还发现血清miR-196a-5p表达水平肿瘤直径，分期和淋巴结是否转移具有显相关性，并且发现血清miR-196a-5p表达量超过3.479（2-ΔΔCt），其诊断乳腺癌的灵敏度为84.1%，特异度80.0%，AUC为0.866具有较高的诊断效能，可能作为诊断乳腺癌的敏感指标。

有研究[24-26]发现miR-339-5p表达在胃癌、结肠癌、肺癌和食管癌等实体肿瘤中出现明显的表达异常。在一项胃癌的细胞株研究发现miR-339-5p出现明显的低表达，高侵袭性的细胞株表达更低[27]。且在结肠癌中得到同样的结论[28]，将miR-339-5p转染到结肠癌细胞中，其侵袭和增殖能力明显降低，形成肿瘤的能力明显降低。本组研究显示乳腺癌组血清miR-339-5p表达水平明显低于良性乳腺疾病组和健康对照组，并且发现乳腺癌术后血清miR-339-5p表达水平出现明显提高，说明乳腺癌与miR-339-5p表达水平具有一定的联系，与Zheng等[29]报道的结论接近，将miR-339-5p基因转染到乳腺癌细胞，发现在裸鼠体内成瘤的时间明显延长，充分说明miR-339-5p基因有类似抑癌基因的特性。在对抑制乳腺癌的机制研究中发现miR-339-5p可以通过抑制BCL-6水平的表达，从而抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移[30]。本组研究还发现乳腺癌肿瘤分期越高，淋巴结出现转移，直径越大，血清miR-339-5p表达越低，同时发现≤1.32（2-ΔΔCt）时，其灵敏度为94.4%，特异度为65.0%，AUC为0.856，在诊断乳腺癌具有较高的诊断效能，故血清miR-339-5p可能为诊断乳腺癌的诊断指标。

本组研究发现血清miR-196a-5p表达水平与miR-339-5p表达呈负相关，并且发现血清miR-196a-5p和miR-339-5p表达水平在诊断乳腺癌的诊断效能均高于CA15-3，联合检测miR-196a-5p和miR-339-5p能够明显提高对乳腺癌的诊断效能，其灵敏度达到91.6%，特异度为88.3%，AUC明显高于单个指标，说明两指标之间存在某种互补性，故联合检测能够提高乳腺癌诊断效能，但其具体作用机制尚需进一步实验证实。综上所述，联合miR-196a-5p和miR-339-5p基因检测有助于对乳腺癌的诊断。