驱动蛋白样DNA结合蛋白、 p21ras在乳腺癌中的表达及与患者淋巴结转移的关系

畅昶，邓青，张勇峰

河南科技大学第一附属医院病理科，河南 洛阳471000

自20世纪70年代以来，全球乳腺癌的发病率呈逐年上升趋势，乳腺癌的防治成为全球公共卫生问题。近些年来乳腺癌的病死率呈明显下降趋势，究其原因与乳腺癌早期筛查、综合治疗方法的开展等密切相关，尽管乳腺癌是目前疗效最佳的实体瘤之一，但由于肿瘤异质性以及病理特征的多样性，导致患者预后不尽相同。研究表明，乳腺癌原发灶以及转移灶间的分子标志物表达水平存在明显差异，临床可根据此特征为乳腺癌后续治疗方案的合理选择提供重要参考。因此积极探究乳腺癌的分子生物学发病机制，寻找特异性标志物，可为乳腺癌的靶向治疗提供参考，对提高乳腺癌患者的临床治疗效果具有积极意义。驱动蛋白样DNA结合蛋白（kinesin-like DNA binding protein，KNSL4）自首次从人乳腺癌细胞系中被发现以来，研究证实其具有微管驱动功能和转录因子功能，与肿瘤的恶性生物学行为密切相关。自国外学者首次从人肺癌细胞中分离出转化基因ras以来，研究表明ras基因与肺癌、大肠癌以及胰腺癌等发生有关，且52%的肺腺癌存在ras基因突变。目前国内外关于ras基因突变产物p21ras基因与恶性肿瘤发病和恶性生物学行为关系的研究成为关注焦点。但目前国内关于乳腺癌淋巴结转移与KNSL4、p21ras基因关系的研究尚处于初步探索阶段，基于此本文展开临床研究，旨在为乳腺癌的早期诊治提供重要参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年1月至2017年12月河南科技大学第一附属医院行乳腺切除术的乳腺癌患者的临床资料和随访资料。纳入标准：符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2015版）》中有关乳腺癌的诊断标准，且经影像学检查确诊；临床资料及随访资料完善；术前未接受放化疗。排除标准：合并其他类型恶性肿瘤；处于特殊时期（如哺乳期、妊娠期等）；合并严重内分泌系统疾病；存在凝血功能异常；术前检查存在远处转移。根据纳入与排除标准，本研究共纳入82例乳腺癌患者，年龄35～56岁，平均（46.01±4.06）岁；TNM分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期38例，Ⅲ期18例；病理分型：鳞状细胞癌8例，腺癌74例；淋巴结转移：阳性48例，阴性34例；分化程度：低分化16例，中分化39例，高分化27例。收集82例乳腺癌患者石蜡包埋的乳腺癌组织及其癌旁组织标本，所有标本均经病理检查确诊。

1.2 免疫组织化学染色法检测KNSL 4、 p21ras表达情况及结果判定

收集乳腺癌组织及其癌旁组织标本，所有标本均采用超敏链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（streptavidin-perosidase，SP）试剂盒（购自福州迈新生物技术开发有限公司）进行染色，二甲苯进行脱蜡处理，梯度乙醇水化，乙二胺四乙酸缓冲液对抗原进行修复（共修复20 min）。滴加一抗（购自美国Abcam公司，配制方法：采用磷酸盐缓冲液按1∶150比例将KNSL4或p21ras单克隆抗体稀释），4℃孵育过夜，然后磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次2 min，滴加二抗（购自北京中杉金桥生物技术有限公司），37℃孵育30 min，然后磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次2 min。二甲基联苯胺液显色，蒸馏水冲洗，明矾苏木素复染，0.2%盐酸分化，再进行乙醇脱水和二甲苯透明及中性树脂封片，最后于光学显微镜下观察。由2名经验丰富的病理医师采用双盲法阅片，KNSL4、p21ras阳性表达呈棕黄色颗粒状，均位于细胞核内，高倍镜下随机观察5个细胞数≥200个的视野。根据阳性细胞占比评分：未见阳性细胞为0分，阳性细胞占比≤10%为1分，阳性细胞占比11%～50%为2分，阳性细胞占比51%～80%为3分，阳性细胞占比＞80%为4分；根据染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两项评分乘积≥2分为阳性，乘积≤1分为阴性。

1.3 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerasechainreaction，RT-PCR）检 测KNSL 4、 p21ras mRNA相对表达量

提取总RNA，逆转录合成cDNA，设计引物并进行三步法扩增，最后对结果进行分析，以β-actin为内参基因，重复测量3次取平均Ct值。采用2法计算KNSL4、p21ras mRNA相对表达量，其中ΔCt=C（t目的基因）-C（t内参基因），ΔΔCt=实验组ΔCt-对照组ΔCt。

1.4 蛋白质印迹法（Western blot）检测KNSL 4、p 21ras蛋白相对表达量

收集KNSL4、p21ras蛋白样品，检测蛋白样品的浓度并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），在蛋白样品中滴加SDSPAGE蛋白缓冲液，100℃沸水加热，蛋白完全变性并冷却后，室温中将蛋白样品直接上样到SDSPAGE凝胶孔中，添加SDS-PAGE电泳液进行电泳，待溴酚蓝达到凝胶孔底端附近时停止电泳，对转膜成功的SDS-PAGE胶进行染色，随后将蛋白膜置于备好的洗涤液中漂洗，经一抗以及二抗孵育后，回收二抗，添加洗涤液，共3次，采用超敏ECL化学发光试剂盒（BeyoECL Plus）检测蛋白相对表达量，以β-actin蛋白为内参物。

1.5 观察指标

①乳腺癌组织、癌旁组织中KNSL4、p21ras的表达情况。②不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中KNSL4、p21ras的表达情况。③依据术后6个月随访结果将患者分为淋巴结转移组（

n

=48）、淋巴结未转移组（

n

=34）。比较淋巴结转移组、淋巴结未转移组患者乳腺癌组织中

KNSL4

、

p21ras

mRNA和蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 乳腺癌组织、癌旁组织中KNSL 4、 p21ras表达情况的比较

乳腺癌组织中KNSL4阳性表达率明显低于癌旁组织，p21ras阳性表达率明显高于癌旁组织，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表1）

表1 乳腺癌组织、癌旁组织中KNSL 4、 p21ras表达情况的比较[ n（%）]

2.2 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中KNSL 4、 p21ras表达情况的比较

有淋巴结转移的乳腺癌患者乳腺癌组织中KNSL4阳性表达率明显低于无淋巴结转移的患者，而p21ras阳性表达率明显高于无淋巴结转移的患者，差异均有统计学意义（

χ

=7.259、8.524，

P

=0.007、0.004）。不同TNM分期、病理类型、分化程度、分子亚型、肿瘤直径的乳腺癌患者乳腺癌组织中KNSL4、p21ras阳性表达率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。（表2）

表2 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中KNSL 4、p 21ras的表达情况（ n=82）

2.3 淋巴结转移组、淋巴结未转移组患者乳腺癌组织中KNSL 4、 p21ras mRNA和蛋白相对表达量的比较

淋巴结转移组患者乳腺癌组织中

KNSL4

mRNA和蛋白相对表达量均明显低于淋巴结未转移组，而

p21ras

mRNA和蛋白相对表达量均明显高于淋巴结未转移组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表 3）

表3 淋巴结转移组、淋巴结未转移组患者乳腺癌组织中KNSL 4、 p21ras mRNA和蛋白相对表达量的比较（± s）

2.4 乳腺癌淋巴结转移与KNSL 4、 p21ras表达量的相关性

Spearman相关性分析结果显示，乳腺癌淋巴结转移与KNSL4表达量呈负相关（

r

=-0.653，

P

＜0.01），但与p21ras表达量呈正相关（

r

=0.608，

P

＜0.01）。

3 讨论

随着国内外学者对乳腺癌生物学行为认识的不断深入，临床对乳腺癌的治疗理念逐步进入综合治疗时代。尽管如此，目前中国女性乳腺癌病死率正以每年3%的速度增长，如何有效降低乳腺癌发病率和病死率成为临床关注焦点。研究表明，乳腺癌转移、复发是导致患者病死率高的关键，而早期有效预测乳腺癌转移风险是提高患者生存率和改善预后的关键。乳腺癌发生、发展是一个复杂的病理过程，研究表明肿瘤细胞生长和恶化与多种癌基因、抑癌基因失活密切相关，任何一种产物异常表达，如某种癌基因过度表达或某种抑癌基因失活，均会引起肿瘤细胞生长失控以及肿瘤细胞向远处侵袭转移。近年来KNSL4、p21ras基因与多种肿瘤发生关系的研究时有报道，KNSL4、p21ras被证实与肿瘤恶性生物学行为密切相关。因此积极探究乳腺癌转移与KNSL4、p21ras基因的关系，或可为乳腺癌及时有效治疗提供参考。

本研究结果显示，乳腺癌组织中KNSL4阳性表达率明显低于癌旁组织，p21ras阳性表达率则明显高于癌旁组织，表明KNSL4、p21ras基因可能参与乳腺癌发生，其中KNSL4在乳腺癌组织中呈明显下调趋势而p21ras则呈明显升高趋势。最初KNSL4基因是作为一种驱动蛋白基因，主要参与染色体运动、分配和纺锤体聚集等生物学行为。但万艳芳的研究指出KNSL4基因表达与患者临床分期、淋巴结转移密切相关，并证实了通过沉默乳腺癌细胞中KNSL4基因可增强肿瘤细胞的侵袭能力，间接说明KNSL4基因或是恶性肿瘤的一种抑癌基因。而本研究结果则证实乳腺癌组织中KNSL4阳性表达率明显下调，且淋巴结转移组患者乳腺癌组织中KNSL4 mRNA和蛋白相对表达量均明显低于淋巴结未转移组，相关性分析提示乳腺癌淋巴结转移与KNSL4表达量呈负相关，由此推测KNSL4可明显抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭，从而降低乳腺癌淋巴结转移风险。肿瘤新生血管在肿瘤发生、发展及转移中具有重要作用，此外，细胞失控性增生也是肿瘤细胞增殖、转移的关键。相关研究证实，KNSL4基因在肿瘤新生血管及细胞失控性增生中具有重要调节作用，故认为KNSL4参与乳腺癌转移的机制可能与其调节肿瘤新生血管及细胞失控性增生有关。但本研究未发现乳腺癌TNM分期、分化程度与KNSL4基因表达的相关性，与上述万艳芳的研究结果不同，可能与本研究对象来源较为集中或样本量较小所致结果存在一定偏倚有关。

ras基因参与多种恶性肿瘤的发生，其作用机制与ras基因突变产生的活化编码产物p21ras蛋白表达量升高密切相关，p21ras位于细胞膜内侧，在传递细胞生长分化信号中发挥关键作用。有研究指出，野生型p21ras在结直肠癌中呈高表达，p21ras基因参与直肠癌病理过程。而本研究则证实乳腺癌组织中p21ras阳性表达率明显高于癌旁组织，且淋巴结转移组患者乳腺癌组织中p21ras阳性表达率明显高于淋巴结未转移组，而进一步相关性分析显示乳腺癌淋巴结转移与p21ras表达量呈正相关，说明p21ras作为一种癌基因，参与乳腺癌转移，促进肿瘤细胞增殖和侵袭。ras基因激活后成为癌基因，研究表明其基因突变形成产物p21ras后，与二磷酸鸟苷的结合能力降低，此时ras蛋白内在的绿色荧光蛋白酶活性也降低，使得ras蛋白以及绿色荧光蛋白酶解离减少，最终肿瘤细胞因失去二磷酸鸟苷与绿色荧光蛋白酶有节制的调节而不可控制地增殖、恶变，故而认为p21ras基因与乳腺癌恶性生物学行为密切相关。

综上所述，乳腺癌淋巴结转移与KNSL4、p21ras基因表达密切相关，KNSL4、p21ras可作为乳腺癌淋巴结转移的一种有效预测标志物。