不同剂量促排卵药物对小鼠焦虑行为和生育力的影响

冯颖 王芊芊 王冲 程兆俊 周文静 章道会 费小阳

在辅助生殖技术（assisted reproductive technology,ART）周期中促排卵药物的使用实质上是对患者添加外源性激素。而性激素水平的改变与各时期女性的焦虑、抑郁状态息息相关[1-2]。研究表明，焦虑状态可以降低施行ART患者的获卵数、正常受精率、优胚率、妊娠率和胚胎种植率[3-4]。然而，目前关于促排卵药物引起患者焦虑行为及对生育力的影响研究少见。本研究拟通过促排卵C7BL/6J近交系小鼠，模拟机体外源性接受超排卵药物状态，并通过高架十字迷宫（elevated plus maze,EPM）实验，利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理，形成动物的矛盾冲突来评估动物的焦虑行为[5-6]；再进行体外受精实验，进一步分析不同剂量促排卵药物对小鼠卵母细胞及胚胎质量的影响，以期为ART周期中制定合理剂量的促排卵方案，减轻患者经济负担和精神压力，改善生育结局提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周龄SPF级C57BL/6J雌鼠，购于上海斯莱克实验动物有限公司，按照SFP级标准饲养于浙江大学实验动物中心屏障系统，适应性饲养1周。本研究经浙江大学动物福利伦理审查委员会批准开展（ZJU20200135）。

1.1.2 主要仪器与试剂 本实验所用仪器为EPM，Any-maze动物行为分析系统6.0（美国Stoelting公司），体式解剖镜（日本Olympus公司，型号：SZ61），相差显微镜（日本Nikon公司，型号：SM2645）等。所用试剂为注射用孕马血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin,PMSG）（丽珠集团丽珠制药厂，5000 U/瓶）、绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）（丽珠集团丽珠制药厂，5000 U/瓶）等。

1.2 方法

1.2.1 小鼠转棒实验 48只4周龄的C57BL/6J雌鼠适应性饲养1周，每天抚触适应环境，进行编号。用Panlab小鼠转棒疲劳测试仪（美国Harvard Apparatus公司，型号：LE8205）对每只小鼠进行检测，设置转速为20 r/min，时间为 5 min。观察小鼠在转棒上的运动，以此评估小鼠运动能力。

1.2.2 小鼠EPM实验 将小鼠逐只放入EPM测试箱中，实验人员在距离测试箱1 m处观察记录下述指标：（1）进入开臂次数；（2）开臂滞留时间；（3）进入闭臂次数；（4）闭臂滞留时间。每只小鼠测试5 min。将48只小鼠按随机数字表法分成4组（5、7.5、10、15 U剂量组），每组12只。促排卵前1 d下午4:00，4组小鼠腹腔注射0.9%氯化钠注射液0.2 ml，30 min后，进行EPM实验，记录数据；促排卵当天下午4:00，4组小鼠分别腹腔注射5、7.5、10、15 U的PMSG 0.2 ml[7]（将PMSG加入0.9%氯化钠溶液稀释配用），48 h后注射相同剂量的hCG（将hCG加入0.9%氯化钠溶液稀释配用），30 min后进行EPM实验，记录数据。

1.2.3 小鼠体外受精实验

1.2.3.1 卵母细胞采集 4组小鼠注射hCG 15 h后采用颈椎脱臼法处死，剖腹取出输卵管放入盛有配子准备液（modified human tubal fluid medium，mHTF）的表面皿中，显微镜下放入矿物油中，找到输卵管膨大部，用解剖针稍刺破膨大部，将卵母细胞团引出，并导入到mHTF培养滴（取卵前1 d，用直径35 mm的培养皿做好，石蜡油覆盖，放入37℃、含5% CO2培养箱中培养12 h）。

1.2.3.2 精子采集 取交配过的性成熟C57BL/6J雄鼠1只，颈椎脱臼法处死，剪下附睾的上体部，用注射针刺破，挤出精子团放入mHTF培养滴中，CO2培养箱中放置1 h再行体外受精。

1.2.3.3 体外受精 将培养1 h的精子悬浮液在镜下检查精子活力和精子数量，然后用移液器按每个培养滴10μl精子悬浮液移入卵母细胞滴（每只小鼠卵母细胞单独放 1滴），将精子终浓度调至（2～4）×106个/ml，放入CO2培养箱中培养，6 h后取出，用移卵管将受精卵移入新的mHTF培养滴中清洗两次，放回CO2培养箱中培养过夜。

1.2.3.4 早期胚胎的形态学评价 培养24 h后的受精卵做镜检，统计胚胎数、未受精卵及异常卵数。其中，正常胚胎和未受精卵形态正常，具有完整的透明带，不含空泡和碎片，细胞质明亮均一。未受精卵细胞不分裂。死亡卵颜色发暗并带有细胞质颗粒；细胞质内含有碎片、部分细胞质溶解的卵为畸形卵；死亡卵和畸形卵都属于异常卵[8]。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism统计软件；计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，组内促排卵前后比较采用配对t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠运动能力评估 适应性饲养期间小鼠体格正常、毛色光亮、行为活动正常。转棒实验显示本实验小鼠运动能力均无异常。

2.2 EPM实验结果

2.2.1 总体活动情况 4组小鼠促排卵前、后总进臂（进入开臂+进入闭臂）次数比较见表1。

表1 4组小鼠促排卵前、后总进臂次数比较（次）

由表1可见，组内比较，4组小鼠促排卵后总进臂次数均较促排卵前减少（均P＜0.05）。组间比较，促排卵前4组小鼠总进臂次数比较差异无统计学意义（P＞0.05）；促排卵后，15 U剂量组小鼠总进臂次数明显少于5 U剂量组、7.5 U剂量组（均P＜0.05）。即促排卵会引起小鼠焦虑行为，且剂量越高，焦虑行为越明显。

2.2.2 开臂活动情况 4组小鼠促排卵前、后进入开臂次数和开臂滞留时间比较见表2。

由表2可见，组内比较，4组小鼠促排卵后进入开臂次数和开臂滞留时间均较促排卵前减少（均P＜0.05）。组间比较，促排卵前4组小鼠进入开臂次数和开臂滞留时间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；促排卵后，10 U、15 U剂量组小鼠进入开臂次数和开臂滞留时间均明显少于5 U剂量组、7.5 U剂量组（均P＜0.05）。

表2 4组小鼠促排卵前、后进入开臂次数和开臂滞留时间比较

2.2.3 闭臂活动情况 4组小鼠促排卵前、后进入闭臂次数和闭臂滞留时间比较见表3。

由表3可见，组内比较，7.5 U剂量组、15 U剂量组小鼠促排卵后进入闭臂次数均较促排卵前减少（均P＜0.05），10U剂量组小鼠促排卵后闭臂滞留时间较促排卵前增加（P＜0.05）。组间比较，促排卵前4组小鼠进入闭臂次数和闭臂滞留时间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；促排卵后，10 U剂量组小鼠闭臂滞留时间明显长于5 U剂量组、7.5 U剂量组（均P＜0.05）。

表3 4组小鼠促排卵前、后进入闭臂次数和闭臂滞留时间比较

2.3 4组小鼠体外受精结果比较 见表4。

由表4可见，4组小鼠平均卵母细胞数、异常卵率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），10 U剂量组卵母细胞数高于5 U剂量组、7.5 U剂量组、15 U剂量组（均P＜0.05），且异常卵率较5 U剂量组和7.5 U剂量组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）。15 U剂量组卵母细胞数明显低于其他3组（均P＜0.05），且异常卵率最高，明显高于其他3组（均P＜0.05）。这表明10 U剂量可以获得最多的卵母细胞，且不增加异常卵率，更高剂量的促排药物反而会抑制卵泡的发育。进一步统计分析发现，10 U剂量组的受精率明显高于5 U剂量组（P＜0.05），10 U剂量组的体外受精平均胚胎数也最高，明显高于其他3组（均P＜0.05），而15 U剂量组平均胚胎数最低，明显低于其他3组（均P＜0.05）。这表明10 U剂量可以获得最多的胚胎。

表4 4组小鼠体外受精结果比较

3 讨论

本研究发现促排卵药物刺激会使小鼠产生焦虑行为，同时过量的促排卵药物对卵子质量也有影响。宗绍波等[9]指出，EPM中总进臂次数、进入开臂次数和开臂滞留时间的复测性度较高，更能体现实验动物趋近-规避冲突的行为结果，是评价动物焦虑表现的主要指标。因此，本研究重点分析了以上数据，发现最低5 U剂量组和最高15 U剂量组小鼠的总进臂次数、进入开臂次数和开臂滞留时间均存在统计学差异。结果表明，促排卵药物会使小鼠会产生焦虑行为，而且随着剂量的增加，小鼠焦虑行为更甚。其他研究者也发现，C57BL/6J雌鼠雌激素水平的改变会影响小鼠的焦虑状态[10]；而在老年的C57BL/6J雌鼠中添加雌激素可以改善小鼠的焦虑及抑郁状态[11]。

PMSG/hCG和雌激素均可以在卵泡发育过程中发挥调节作用。因此本研究通过体外受精实验，研究了促排卵药物对小鼠生育力的影响。结果发现，各组小鼠平均卵母细胞数和平均胚胎数存在统计学差异。其中，10 U剂量组平均卵母细胞数、平均胚胎数均显著高于其他3组，可能为C57BL/6J小鼠最佳超排剂量。而增加促排卵药物剂量至15 U后，小鼠平均卵母细胞数和平均胚胎数均下降。此外，不同剂量促排卵后小鼠异常卵率也存在差异；其中，15 U剂量组小鼠异形卵率最高。因此笔者推测，随着促排卵药物剂量的增加，小鼠卵细胞的质量明显下降，异常卵数和异常卵裂率均上升。Ertzeid等[12]也提出，卵巢刺激会损害小鼠卵母细胞/胚胎质量以及子宫环境，因此笔者提倡使用较小剂量的PMSG/hCG对小鼠进行促数排卵。

综上所述，PMSG/hCG促排卵药物会使小鼠产生焦虑行为，并且随着促排卵药物剂量的增加焦虑行为也更明显；此外，高剂量的促排卵药物会降低卵细胞的质量，增加异常卵的风险。本研究为ART中促排卵药物对患者情绪的影响提供了实验室依据，也为制定合理剂量的促排卵方案提供参考。