固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法分析环境水样中5种酚类化合物

刘友彬，李玉阳，李燕*

(1. 济南大学 化学与化工学院，山东 济南 250012；2. 山东省化工研究院，山东 济南 250014)

作为重要的高分子化工原料，酚类化合物(双酚类和烷基酚类)广泛应用于各个领域。在我们的日常环境中，酚类化合物会以微量或者痕量的水平存在，其理化性质较为稳定，不易降解，因此会在环境中长期存在，产生潜在的危害风险，并通过食物链等各种途径污染环境水源等介质，最后进入人体，影响人体代谢生理平衡，进一步引发疾病[1-2]。因此建立环境水样中此类物质的分析测定方法，对考察环境水体中酚类化合物的含量及保护人类健康有重要的意义。

目前，报道较多的关于此类物质的测定方法有气相色谱法[3]、液相色谱法[4]、气相色谱-质谱法[5]、液相色谱-质谱法[6]、毛细管电泳法、酶联免疫吸附测定法等。气相色谱和液相色谱分析时间较长；气相色谱-质谱联用法测定双酚类物质需要衍生化步骤，过程较为繁琐；液相色谱-质谱联用法是利用液相色谱作为质谱进样系统，使复杂的化学组分得到分离，再利用质谱作为检测器进行定量分析，准确性和灵敏度优势明显；毛细管电泳法、酶联免疫吸附测定法主要用于单种酚类物质的分析。高效液相可以缩短色谱分离时间，和质谱法联用进一步提高了准确性和快捷性。环境水样中酚类化合物含量较低，会增加样品的检测难度，再者就是样品基体会比较复杂，可能存在一些干扰，也会影响样品的萃取效果，所以对样品进行预处理显得格外重要。

目前关于酚类化合物的样品前处理技术主要有液-液萃取、分散液-液萃取、微波辅助提取萃取、固相萃取、基质辅助固相萃取、快速萃取试剂盒等。固相萃取(solid-phase extraction, SPE)是使用固定相吸附剂对液体样品中的目标物进行萃取，从而使目标物脱离样品的基体和干扰物，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和富集目标物的目的[7]。作为一种重要的前处理手段，有着操作简便、准确、快速及便于实现自动化等优点，广泛应用于食品、医药和环境等领域。

目前很多方法主要集中在对单个双酚类物质的测定，同时测定水中多种双酚类化合物的报道较为少见。本文以环境水体为研究对象，分别对固相萃取条件(pH、样品流速、洗脱剂种类、洗脱剂用量)、质谱条件(质谱离子源、监测反应模式)、色谱条件(流动相的比例)进行优化，建立了全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法。该方法可同时分析5种酚类化合物，即双酚A(BPA)、双酚F(BPF)、双酚S(BPS)、n-壬基酚(NP)、n-辛基酚(OP)。本方法可为环境水中酚类化合物的定性定量分析提供技术保障，亦可为其他样品中酚类化合物分析提供借鉴。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

超高液相色谱-电喷雾串联质谱仪(Agilent 1260+6460B QQQ)；固相萃取仪(Dionex SPE-280)；氮吹浓缩仪(Biotage)；超纯水制备仪(Millipore Milli-Q Integral15)；色谱柱Thermoforms C18(2.6 μm, 2.1 mm×100 mm) (Thermoforms)。

BPA(标准品，纯度不低于99.9%)； BPF(标准品，纯度不低于99.9%)； BPS(标准品，纯度不低于99.9%)； NP(标准品，纯度不低于99.9%)； OP(标准品，纯度不低于99.9%)；乙腈(色谱纯)；乙酸铵(分析纯)。

1.2 样品的采集与保存

样品采集根据《水质采样技术指导》[8]要求的方法操作，用4 L棕色玻璃瓶采集每个点位的样品。样品须在4 ℃冰箱冷藏保存，并在24 h内进行分析测试。

1.3 样品前处理

预先用6 mL甲醇，达到去干扰和活化固相萃取柱(Waters, cc 500 mg)的目的，再用6 mL纯水通过小柱条件化。采集1000 mL水样，加入硫酸调节pH为6左右，以10 mL/min流速通过活化的固相萃取柱，完成固相萃取富集。加入10 mL纯水，然后抽空气30 min，加入10 mL二氯甲烷/乙腈洗脱，将洗脱液氮吹干，用1 mL乙腈/水定容，待测。

1.4 仪器条件

图1 酚类化合物的色谱图Fig.1 Chromatogram of phenolic compounds

质谱实验条件：采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式监测，监测模式采用多级反应监测模式(MRM)。毛细管电压为4.0 kV，离子源温度为500 ℃，气帘气(CUR)压力为40 psi(1 psi=6895 Pa)，喷雾针电压为-4500 V，喷雾气(GS1)压力为55 psi，碰撞气(CAD) 压力为Medium，目标扫描时间为0.1 s，入口电压(EP)为10 V，出口电压(CXP)为13 V，脱溶剂温度350 ℃，氮气流速480 L/h。各化合物的质谱条件见表1。

表1 酚类化合物的质谱条件

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件优化

为了得到最优的实验条件，分别对萃取条件如pH、样品流速、洗脱剂种类、洗脱剂用量进行探讨和优化。用样品的回收率来表征实验条件的优化，其计算如下式：

(1)

pH是影响样品萃取效率的重要参数之一，pH的大小与水样中化合物的存在状态有很大关系。我们考察了样品的pH分别为2、4、6、8、10时，对酚类化学物萃取效率的影响，见图2。当pH为2～6时样品的回收率逐渐增大，当pH=6时，可以看出5种酚类化合物的回收率最高；当pH为6～10时，样品的回收率逐渐降低。可见pH过高或过低都会影响样品的回收率，因此，选择pH为6作为最佳的pH条件。

图2 pH对酚类化合物萃取效率的影响Fig.2 Effect of pH on extraction efficiency of phenolic compounds

样品流速的大小是考察固相萃取过程中目标物能否有效富集的重要因素，实验研究了样品流速在2、4、6、8、10 mL/min时的萃取效果。由图3可以看出，当流速在2～6 mL/min时，样品的回收率随着流速的增大而提高。当流速在6～10 mL/min时，回收率随样品流速增加而降低。可能流速过大，不能保证样品的目标物在固定相汇总从而有效保留。为了达到更好的萃取效果，采用6 mL/min作为最佳样品流速。

图3 样品流速对酚类化合物萃取效率的影响Fig.3 Effect of sample flow rate on the extraction efficiency of phenolic compounds

作为影响固相萃取效果的重要参数，洗脱液的种类在实验优化过程中也是必不可少的。当把两种不同的极性物质放在一起时，除了各自分子间存在着取向力外，两种不同分子间还存在着取向力，因此两种不同的极性物质可以相互混溶，即“相似相溶”原理。我们考察了常用的有机溶剂，包括甲醇(1)、乙腈(2)、丙酮(3)、甲醇/二氯甲烷(4)和乙腈/二氯甲烷(5)5种溶液作为洗脱液的萃取效果，由图4可以看出，乙腈/二氯甲烷的洗脱能力明显高于其他4种洗脱液。因此，选择乙腈/二氯甲烷作为本实验的洗脱液。

图4 洗脱剂种类对酚类化合物萃取效率的影响Fig.4 Effect of eluent type on the extraction efficiency of phenolic compounds

洗脱剂的用量同样会影响SPE的效率，考察了洗脱剂用量在2、4、6、8、10 mL时的萃取效果，见图5。在2～6 mL范围内，随着洗脱剂用量的增加而增加。当洗脱剂的用量继续增大时，回收率基本不变。因此，选择6 mL洗脱剂作为最佳洗脱剂用量。

图5 洗脱剂用量对酚类化合物萃取效率的影响Fig.5 Effect of eluent content on the extraction efficiency of phenolic compounds

2.2 色谱条件的优化

液相色谱分析中，流动相的组成不仅影响目标物的色谱峰型和分离效果，且直接影响检测器的响应值和检测灵敏度。考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-5 mmol/L乙酸铵、甲醇-5 mmol/L乙酸铵4种流动相体系对5种化合物的分离效果。以信号响应值、峰型和干扰程度作为评价效果的依据。与甲醇-水相比，甲醇-5 mmol/L乙酸铵、乙腈-5 mmol/L乙酸铵为流动相时，待测物的响应值更高，提高了待测组分分离度。与乙腈-水相比，乙腈-5 mmol/L乙酸铵为流动相时，对同一标样，各化合物的回收率在85%～115%，可以看出在该流动相下的目标物的离子化效果更好; 5种化合物的色谱峰均没有拖尾或者前展宽的现象，峰型更好；灵敏度更高。主要原因是由于甲醇和目标酚类间存在一定的氢键作用，所以色谱图存在不同程度的拖尾现象，乙酸铵的加入改善了这种拖尾现象，而目标物在乙腈存在的条件下可以提高信号响应强度。因此，采用乙腈-5 mmol/L乙酸铵为流动相。

2.3 质谱条件的优化

多级反应监测模式质谱条件的优化主要包括监测离子模式、定量和定向离子选择及仪器参数的设置。优化质谱条件的目的是为了找出保留时间和分析物峰之间的最佳分辨率，使样品中每种物质的离子化效率达到最佳。采用负离子模式测定酚类化合物时，因为每种化合物自身带有羟基，容易去质子化，形成负离子峰，因此选用负离子模式定量检测。用针泵进样100 μg/L的BPF、BPS、BPA、NP和OP的混合溶液，在负离子模式下进行全扫描以选择适当的电离方式和分子离子峰。根据目标化合物的理化性质，选取ESI作为电离源。实验中，以5种物质的分子离子为基础，采用子离子扫描方式选择最优的两特征离子确定化合物的定量离子和定性离子，并优化碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)使子离子的强度最大。配制5种物质的混标，以多反应监测(MRM)方式优化雾化气(GS1)、辅助气(GS2)、气帘气(CUR)、碰撞气(CAD)、离子源电压(IS)、离子化温度(TEM)等质谱参数(表2)，使样品中每种物质的离子化效率达到最佳。根据母离子与丰度高、干扰小的两个子离子形成的离子对分别进行定性、定量分析。

表2 酚类化合物的质谱条件优化结果

2.4 方法建立

本方法使用外标法定量。用初始流动相稀释并配制浓度分别为1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L BPA、BPS、BPF、NP和OP标准系列。按照浓度从小到大的顺序，依次上机测定，标准曲线通过浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制，进一步得出线性方程和回归系数。通过重复7次空白实验计算得各组分最低检测浓度，依据HJ168—2010[9]要求计算最低检出限和方法定量限，得出方法定量限，结果见表3。由表3可知，5种酚类化合物在一定范围内呈现良好的线性关系，相关系数范围为0.997 9～0.999 7，满足定量分析的需求。

表3 各目标物的线性方程、相关系数、方法检出限和定量限

选择一种类型已知且目标物未检出的环境水样(如地下水)进行前处理。对每类水样分别选取高、中、低3个浓度进行加标实验，按全程序经固相萃取富集后测定，每个样品平行测定5次，计算不同浓度水平样品的相对标准偏差、加标回收率等参数。由表4可以看出，方法的精密度在2.54%～7.88%，回收率在89.40%～104.20%，说明该方法可行。

表4 各目标物的相对标准偏差和回收率(n=5)

和已有文献中酚类化合物检测方法比较，结果如表5所示。本文方法使用高效液相色谱和质谱联用，提高了目标物的灵敏度。该方法检出限更低，精密度良好，回收率较好，准确度高，另外分析时间(5 min)较短，节约了仪器测试时间。上述结果表明，本实验建立的方法适用于水中多种酚类化合物的分析。

表5 环境水样中酚类化合物检测方法对比

2.5 样品分析

采集4种类型的环境水样进行实际样品分析，按全程序经固相萃取富集后测定，每个样品平行测定5次，其中地表水样品色谱图见图6(a)，BPA处的质谱图见图6(b)。由表6可以得出，地表水检出BPA含量为1.06 ng/L，其余样品中均未检出目标物。

图6 地表水样品色谱图和质谱图Fig.6 MRM chromatogram and MS of surface water

表6 环境水样中各目标物的分析结果(n=5)

3 结论

本文建立了环境水样中5种酚类化合物的固相萃取-高效液相色谱-串联质谱的分析方法。5种酚类化合物的检出限为0.05～0.15 ng/L，定量限为0.20～0.65 ng/L，方法的精密度在2.54%～7.88%，回收率在89.40%～104.2%。该方法准确可靠，可以为环境水样中酚类化合物的污染特征和分布规律研究提供相应的方法依据，也可以为后续国家相关标准的建立提供参考。