影响“御金香”黄茶γ-氨基丁酸含量的因素研究

伊 冉，黄晓琴*，姜忠磊，杨小青，于 敏，刘亭亭

1.山东农业大学 园艺科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.日照市岚山区茶业技术推广服务中心，山东 日照 276800；3.山东泰山茶溪谷农业发展有限公司，山东 泰安 271022

γ-氨基丁酸（GABA）是一种具保健作用的非蛋白质氨基酸，具有降血压、降低胆固醇、改善心率和睡眠、增强记忆力、抗焦虑、抗疲劳[1-8]等作用。自1987年日本开始研究γ-氨基丁酸茶叶以来，国内的许多专家也相继开展高γ-氨基丁酸茶叶的研究，大多是通过一些厌氧技 术[1、9]的处理来提高茶叶中γ-氨基丁酸的含量，而针对茶叶自身中γ-氨基丁酸含量及其影响因素的研究较少。

目前，对茶叶中γ-氨基丁酸（GABA）的研究多集中在白茶[10-11]、绿茶和红茶[12]，近几年也有对岩茶[13]等的研究，而对黄茶的研究还比较少见。黄茶被称为最适合人体饮用的茶[14]，近年来随着消费水平的提高和消费习惯的改变，黄茶也逐渐兴起。黄茶由于其独特的“闷黄”工序成就了“黄汤黄叶”的品质特点，而在黄茶“闷黄”工序过程中，本身就存在一定的厌氧环境，本文拟对影响黄茶中γ-氨基丁酸含量的因素进行研究，通过设置不同的工艺参数（如摇青时间、闷黄时间、闷黄温度等）、采摘不同季节茶树鲜叶加工成黄茶，比较不同条件下黄茶γ-氨基丁酸（GABA）含量的变化，为探究黄茶中γ-氨基丁酸（GABA）含量及其影响因素提供参考，为开发高品质且具一定保健功能的黄茶提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用鲜叶原料均为一芽二叶初展，品种为御金香，采自泰安市泰山茶溪谷农业发展有限公司茶园。

1.2 实验所用试剂

十二水磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，茚三酮，氯化亚锡；17种氨基酸标准品（sigma，纯度≥99.9%），HPLC级乙腈，盐酸（国药集团化学试剂有限公司，优级纯，36.0% ～ 38.0%），正亮氨酸，三乙胺（国药集团化学试剂有限公司，优级纯，纯度≥99.0%），异硫氰酸苯酯（sigma，纯度≥99.9%），正己烷（国药集团化学试剂有限公司，优级纯，纯度≥97.0%），冰醋酸（生工，纯度≥98%），无水乙酸钠（国药集团化学试剂有限公司，优级纯，纯度≥99%）。

1.3 试验仪器

分析天平；岛津UV－2450型分光光度计；RIGOL L3000高效液相色谱仪（紫外检测器波长 254 nm）。

1.4 试验处理与方法

本试验黄茶加工工艺流程为增加了摇青工序的新工艺：鲜叶→摊放→摇青→杀青→揉捻→闷黄→干燥。通过预实验确定黄茶加工工艺为：摇青时间2 min；滚筒杀青温度260℃；揉捻 20 min；40℃进行闷黄 14 h；干燥温度为初烘130℃，足干90℃，80℃提香2 h。各试验样品工艺参数在此基础上进行不同的变量设置。

摇青时间处理：选用7月份采摘的御金香一芽二叶初展鲜叶作为原料，摇青时间分别设置为 1 min、2 min、3 min，其他加工参数同预试验工艺进行处理。

闷黄时间处理：选用7月份采摘的御金香一芽二叶初展鲜叶作为原料，闷黄时间分别按梯度设置为 4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h，其他加工参数同预试验工艺处理。

闷黄温度处理：选用7月份采摘的御金香一芽二叶初展鲜叶作为原料，闷黄温度分别设置为35℃、40℃、45℃，其他加工参数同预试验工艺进行处理。

不同季节黄茶加工试验：选用5月份、7月份、9月份采摘的御金香一芽二叶初展鲜叶作为原料，加工流程同预试验工艺进行处理。

1.5 测定条件与方法

游离氨基酸测定方法参照GB/T 8314—2013。GABA测定方法：γ-氨基丁酸（GABA）测定采用HPLC法，色谱柱为赛分Amethyst C18-H（250 mm*4.6 mm, 5 μm）。

供试液的准备：0.1 mol/L盐酸：取900 uL浓盐酸加入100 mL水，混匀；三乙胺乙腈溶液：取2.8 mL三乙胺加入17.2 mL乙腈，混匀；异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取125 uL异硫氰酸苯酯加入10 mL乙腈，混匀；正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸2 mg，加入0.1mol/L盐酸水溶液2 mL 溶解，混匀。

前处理：称取约0.1 g样品，加入1 mL水，研磨成浆后移入EP管中，过夜浸提，10000 g离心，取上清，过滤膜待衍生。

氨基酸的衍生：取上述待衍生的清液200 μL，氨基酸标准品溶液200 μL，分别置于2 mL EP管中；往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20 μL；依次向每个EP管中加入三乙胺乙腈溶液 100 μL（确保 PH > 7）和异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀后25℃下放置1 h。然后加入正己烷400 μL至每个EP管中，摇晃后放置10 min。取下层溶液，0.45 μm针式过滤器过滤后上机检测。

流动相：流动相A：称取7.6 g无水乙酸钠，加水925 mL,溶解后用冰醋酸调节pH至6.5，然后加入乙腈70 mL,混匀，用0.45 μm滤膜过滤。流动相B：80%乙腈水溶液。

色谱条件：进样量10 μL；流速1.0 mL/min； 柱温40℃；走样时间为45 min。

1.6 数据处理

采用Excel 2003统计分析软件进行基础的数据整理与收集，并利用 IBM SPSS Statistics 26软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC 法测定 GABA 结果

在试验方法中所述的高效液相色谱条件下，对 GABA 的单标和待测样品（春季“御金香”黄茶样品）进行测定，GABA标样和待测样品经衍生后获得的图谱如下图1、图2所示。由图1 GABA标品谱图所知，出峰时间在12.26 min左右。在此色谱条件下，经处理后的待测样品在12.32 min左右时检测到GABA（图2）。

图1 实验标品HPLC谱图Figure 1 HPLC spectrum of experimental standard

图2 春季御金香黄茶样GABA HPLC谱图Figure 2 HPLC spectrum of GABA in Yujinxiang yellow tea in spring

表1 流动相梯度Table 1 Gradient of mobile phase

2.2 不同摇青时间对黄茶GABA含量的影响

为使加工成的黄茶更有特色，香气显花香，在传统黄茶加工工艺的基础上，增加了摇青工艺，并设置 1 min、2 min、3 min 的不同摇青时间处理。通过对加工成的干茶中游离氨基酸总量和γ-氨基丁酸（GABA）含量的测定，结果表明（表2）：游离氨基酸含量与摇青时间成反 比，在摇青1 min时含量最高，但与摇青2 min处理无显著差异，二者与摇青3 min处理有显著差异；γ-氨基丁酸（GABA）含量随着摇青时间增加呈现先上升后下降的趋势，在摇青2 min时含量最高，各处理之间差异显著。

表2 不同摇青时间黄茶游离氨基酸、GABA含量Table 2 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different time of shaking

2.3 不同闷黄时间对黄茶GABA含量的影响

结果表明（表3）：游离氨基酸含量随着闷黄时间加长呈现先增加后降低的趋势，8 h、10 h与12 h样品间含量无显著差异，在闷黄12 h左右时含量最高。γ-氨基丁酸（GABA）含量随着闷黄时间延长呈现先增加后降低的趋势，在6 h左右出现最大值，与其他组之间有着显著差异，且其他各处理间均有显著差异。从数据分析可得，在闷黄 4 ～ 6 h 这一范围内，γ-氨基丁酸（GABA）含量较其他时间段有着明显的增加趋势，而6 ～ 8 h时段相对其他时间段含量要高。

表3 不同闷黄时间黄茶游离氨基酸、GABA含量Table 3 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different time of yellowing

2.4 不同闷黄温度对黄茶GABA含量的影响

结果表明（表4），游离氨基酸的含量与闷黄温度成反比，在35℃含量最高，各处理之间有显著差异；而γ-氨基丁酸（GABA）呈现相同变化趋势，各处理之间存在显著差异。

表4 不同闷黄温度黄茶游离氨基酸、GABA含量Table 4 Content of free amino acids and GABA in yellow tea at different temperature of yellowing

2.5 不同季节鲜叶对黄茶GABA含量的影响

结果表明（表5），游离氨基酸总量随着季节变化逐渐降低，各季节之间存在明显差异，春季含量最高。γ-氨基丁酸（GABA）含量在三个季节样本之间均有显著差异，且春季含量最高，夏季最低，含量随季节变化较为明显。

表5 不同季节黄茶游离氨基酸与GABA含量Table 5 Content of free amino acids and GABA in yellow tea in different seasons

3 讨论

研究表明，摇青能够改变鲜叶内酶的活性，增加水浸出物含量，并产生更多的芳香物质[15]。因此，近年来，在许多茶的加工工艺中都引入了摇青工艺，如花香型绿茶、黄茶、红茶、白茶等的生产[16-19]。通过本试验的研究发现，摇青在增加茶叶香气物质的同时，还能够提高黄茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量。刘冠卉[11]等人在研究桑叶红茶时曾提出，摇青工艺增大叶片之间的摩擦振动，能够给叶片造成轻微的机械损伤，从而激活谷氨酸脱羧酶（GAD）活性。GAD是催化谷氨酸生成γ-氨基丁酸的催化酶，是一种逆境酶,植物在低温、厌氧及机械损伤等逆境条件下可激活酶促反应[20]，而摇青处理造成的机械损伤打破了底物与酶之间的间隔使得接触增大、加速叶片的无氧呼吸和内部环境的酸化，同时，摇青造成的振荡促进了叶片内水分、物质的运输与重新分布，这些动态反应均有利于GAD的酶促反应，进而使得叶片中GABA含量增加[21]。但在摇青时也需注意，虽然随着摇青时间的增加，GABA含量会有上升过程，但超过阈值会产生相反效果，且因原料嫩度较低，易造成叶底红边，同时也会对滋味与香气产生不良影响，造成茶叶品质的降低，所以摇青时间也不可一味的增加，要根据实际情况进行调整。

本试验选用湿闷工艺进行闷黄，文帅[22]等人在对闷黄工艺进行研究时发现湿闷有利于游离氨基酸含量的增加。范方媛[23-24]等人在研究闷黄工艺因子对黄茶品质滋味影响时发现，γ-氨基丁酸（GABA）含量会随着闷黄温度的提高而增加，本文的试验结果与其相一致。一些研究表明，在闷黄温度变化上，随着闷黄时间的增加，前期大分子蛋白质物质在湿热和酶促作用下水解[25]，导致氨基酸含量的增加，而后期氨基酸和可溶性糖等物质结合发生孟拉德反应[26-28]，含量会相应的减少，本文试验结果也与此相一致。且有研究显示，虽然多酚氧化酶等酶类在杀青之后会大幅下降, 但随着闷黄过程的深入,多酚氧化酶、过氧化氢酶和纤维素酶的活性会显著增加，增加至一定程度, 随后逐步减少[28]，相应地在GABA合成机制中起到重要作用的谷氨酸脱羧酶（GAD）可能也具有同种变化规律，从而造成其含量在增加到某一时刻后开始减少，从而使得其GABA含量也呈现相同的变化规律。

与其他茶树品种相比，“御金香”呈现出明显的品种特点，“御金香”是典型的光照敏感型黄色系白化茶品种[29-30]，以氨基酸含量高、酚氨比低为优势，成为近些年来绿茶鲜叶原料的热门选择，而将其作为黄茶加工的原料还少见报道。在本次试验中发现，采摘自春季的“御金香”鲜叶所加工成的黄茶，氨基酸总量与γ-氨基丁酸（GABA）的含量与其他季节差异显著，达到所有样本的最大值，品种优势极为明显，加上其特殊的鲜叶色泽特点，不失为黄茶原料的新选择，为高品质黄茶的加工提供了新思路。Zhao[31]等人对常规白茶、绿茶、乌龙茶和黑茶中的γ-氨基丁酸（GABA）含量做了测定，其中白茶含量最高，为 45.7 mg/100 g[32]，而本研究中利用春季御金香茶树品种加工成的黄茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量为121.24 mg/100 g，远远高于常规工艺中加工成的各类茶，可见利用高氨基酸含量的茶树品种加工γ-氨基丁酸茶具有一定优势。由于本试验其他工序处理选用的鲜叶均采自夏季，氨基酸含量明显下降，这是由于山东地区夏季日照强，茶园通常都会做遮荫处理，而“御金香”茶树的另一特征是遮荫处理后氨基酸含量明显下降，从而造成其结果的出现。

本次研究发现，鲜叶采摘季节与加工工艺均会对成品黄茶中γ-氨基丁酸（GABA）的含量产生不同程度的影响。引入摇青工艺、选择适当的闷黄时间和闷黄温度都有利于黄茶中γ-氨基丁酸（GABA）含量的增加。在本研究的基础上，如何进行高γ-氨基丁酸（GABA）含量黄茶的生产是值得进一步研究的内容，但本研究的试验结果也为高γ-氨基丁酸（GABA）含量黄茶的生产提供了一定理论基础。