一株饲用贝莱斯芽孢杆菌的分离鉴定及其生理特性

钟丽娟， 张庆华

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000）

近年来，随着畜牧业的快速发展，人畜争粮、饲料转化率低、环境污染等问题都已成为养殖业发展的瓶颈，尤其是人们对食品安全、环境问题的关注，使得畜牧业抗生素滥用问题的解决刻不容缓，寻找新的抗生素替代品已成为畜牧业生产亟待解决的需求。生物饲料为丰富非粮饲料资源、提高饲料转化率、“减抗”“替抗”及缓解环境污染提供了综合的解决方案。微生物菌种是生物饲料功能和质量的基础，直接关系到产品安全和生物安全性，世界各国对此都有明确规定和严格管理。我国农业农村部《饲料添加剂品种目录（2008）》中规定可用于直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂菌种有16种，但对可饲用微生物资源的开发利用还远远不够。畜禽肠道内分布着与宿主营养代谢紧密相关的微生物群落，这些微生物更能够适应宿主肠道内的生态环境，可以协助宿主分解难以消化吸收的营养物质，具有良好的开发应用潜力。因此，本研究以规模化养殖的肉鸡肠道为来源，分离筛选可以产生纤维素酶、淀粉酶的微生物菌株，并开展生物安全性初步研究，旨在筛选优良的饲用微生物菌种资源，为开发更适宜配合玉米-豆粕型饲喂方式的微生物添加剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和预处理 肉鸡样品来源于朝阳县柳城镇木头沟村养殖小区，肉鸡品种为白羽肉鸡AA+，饲养时间为42 d。将试验肉鸡带回实验室，用手术剪刀剪断颈静脉处死后，立即剖开腹部，按组织学区分各肠段，用无菌棉线结扎所取各肠段的两头，并自结扎处外端1 cm处剪断，用酒精棉球消毒各结扎部位，所剪取的不同组织分装在无菌三角瓶中，无菌塑料膜封口后放入4℃冰箱，备用。

1.2 培养基及试剂 淀粉培养基（g/L）：可溶性淀粉10 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，琼脂20 g。羧甲基纤维素钠CMC-Na培养基（g/L）：CMC-Na 5.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，酵母膏0.5 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.2 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.0。上述培养基分装至500 mL三角瓶中，121℃灭菌30 min，放凉至45℃左右时，向直径为90 mm培养皿中加入15 mL培养基，凝固完全后，将平皿倒置于30℃培养箱中去除水汽，备用。

LB斜面培养基（g/L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，琼脂20 g，pH 7.0～7.2，分装至三角瓶，并制备50支试管斜面备用。LB液体培养基（g/L）：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，pH 7.0～7.2。

淀粉酶-液体产酶培养基：豆饼粉4%，玉米粉3%，NaH2PO40.8%，（NH4）2SO40.4%，NH4Cl 0.2%，CaCl20.4%，pH 6.5。纤维素酶-液体产酶培养基（g/L）：豆饼粉5 g，麸皮20 g，NaH2PO40.4%，（NH4）2SO40.2%，煮沸10 min，pH自然。上述液体培养基分装至500 mL三角瓶中，装液量为50 mL，121℃灭菌30 min，备用。

碘染色液：1 g I和2 g KI用蒸馏水定容至300 mL，棕色瓶保存备用。

1.3 菌种初筛 采用稀释涂平板法，取事先已称重的灭菌塑料离心管，用镊子将肉鸡盲肠中的内容物挤入离心管中，称重，用无菌水稀释至10倍稀释液备用。取5支含9 mL无菌水的试管，用移液器将样品分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，将10-4、10-5、10-6三个稀释梯度的样品用移液器分别吸取0.1 mL滴入对应的淀粉培养基平皿中，用刮铲涂抹均匀，标记清楚，每处理3次重复。将平皿放置于35℃恒温培养箱中培养24 h后，挑取菌落数为5～50个菌落的平板，挑取其中产生透明圈较多，透明圈较为明显的1块平板，用记号笔将产生透明圈的菌落进行编号标记，使用游标卡尺分别测定菌落直径（I）和透明圈直径（D），将D/I值大于3.0的菌株进行2～3次划线纯化后，转接至LB斜面培养基上，培养48 h后，放置于4℃冰箱保藏。

1.4 菌种复筛试验 将细菌斜面菌种分别点接至CMC-Na平板中央，35℃培养48 h后，用游标卡尺测定菌落直径后，将平板中倒入10 mg/mL刚果红染色液进行染色1 h，将平板用1 mol/L NaCl溶液缓慢冲洗，去掉浮色，产纤维素酶活的菌落周边会出现透明圈，测定对应的菌落直径（I）和透明圈直径（D）。

1.5 液体产酶能力测定 将细菌斜面菌种接种至LB液体培养基中，35℃、180 r/min培养18 h后，按1%接种量分别接种至两种液体产酶培养基中。35℃、180 r/min，培养40～48 h后，将培养液于4℃、6000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液。淀粉酶活力测定参照食品工业酶制剂国家标准GB1886.174-2016的中温α-淀粉酶测定方法（国家标准，2016），内切型-β-葡聚糖酶（CMC酶）活力测定参照沈雪亮（2002）等方法进行。

1.6 菌种鉴定 形态学鉴定：采用划线法将冰箱保藏菌种接种至LB平皿上，培养48 h，观察并记录菌落特征，采用美兰染色法，于尼康相差显微镜下镜检菌体形态，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》（布坎南，1984）和《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠，2001）进行形态学初步鉴定。

菌株16S rDNA序列分析：用无菌水将培养48 h的LB斜面试管中的菌体洗下，装入EP管于-20℃保存备用。DNA提取使用上海生工生物工程股份有限公司Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行。PCR引物选择通用引物16S rDNA（7F-1540R和27F-1492R）。反应体系及反应条件参照周宏璐（2010）方法进行。扩增产物寄送至上海生工生物工程股份有限公司（上海）进行纯化与测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对。

1.7 安全性试验 试验所用蓝色斑马鱼来自上海亿诺水族科技有限公司，试验鱼同一批次孵化，体长约3～5 cm，无明显疾病和畸形，试验前每日早晚饲喂2次丰年虾，感观饱食，预饲养15 d后，死亡率为3%，小于5%，符合试验用鱼要求。挑选体长一致、健康活泼的斑马鱼进行安全性试验。菌液处理：每500 mL三角瓶中装入200 mL自来水，121℃灭菌30 min，放置1 d后使用。试验时于无菌条件下将LB斜面培养基上的菌体用无菌水冲下，调整菌体浓度为2×107cfu/mL和2×109cfu/mL，分别转入500 mL三角瓶中。设置2个浓度处理，无菌水为对照，每处理5次重复。试验鱼处理：将全部试验鱼经5次无菌水洗涤，每次200 mL洗涤2 min，每个三角瓶中放入3条斑马鱼，操作过程中要迅速准确，尽量无菌操作，饲养周期为30 d，期间记录斑马鱼生长状态。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果 由表1可知，采用稀释涂平板法自肉鸡盲肠中分离获得6株在淀粉培养基可水解产生较大透明圈的菌株，其D/I值均大于3.0，具有较强的产淀粉酶活性。将具有产淀粉酶能力的6株细菌菌株点接至CMC-Na平板测定菌株产纤维素酶活性，试验结果表明，菌株CY-02、CY-03、CY-06具有产纤维素酶能力，其中菌株CY-03产酶活力较强。

表1 菌株筛选结果

2.2 产酶能力测定结果 由表2可知，菌种CY-03的综合产酶能力较好，培养40 h时中温α-淀粉酶活力达89.47 U/mL，培养48 h时CMC酶活力可达65.63 U/mL，表明该菌株具备良好的应用价值。

表2 液体产酶测定结果 U/mL

2.3 菌株鉴定结果 菌株CY-03接种于LB培养基上，35℃培养48 h后，菌落呈乳白色，圆形，边缘波状，表面干燥，褶皱，不透明，黏液性，菌落较小，直径为2.0～4.0 mm。镜检可见菌体为杆状，长约1.15～1.69μm，宽约0.38～0.56μm。芽孢椭圆形或柱状，端生，长约0.76～1.0μm，宽约0.45～0.55μm。根据形态学初步判断该菌为芽孢杆菌属细菌。16S rDNA测序及NCBI数据库Blast比对结果表明，该菌与Bacillus velezensis属细菌的序列同源性为100%，结合形态学鉴定结果，确定该菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

2.4 安全性试验结果 由表3可知，斑马鱼在菌体浓度为1×107cfu/mL的高浓度菌液中浸浴饲养30 d未出现异常，斑马鱼生理状态仍健康活泼，表明该菌株生物安全性较好，具备较好的应用潜力。

表3 菌株CY-03的安全性试验

3 讨论

3.1 菌株的筛选与鉴定 生物饲料开发利用的核心技术在于饲用微生物菌种资源及其菌种功能的深度挖掘。作为一种重要的战略资源，饲用微生物菌种资源的收集、保藏与评价工作至关重要。在国内外允许使用的饲用微生物资源的基础上，近年来更多的关注放在肠道微生物资源开发利用方面。本试验从肉鸡肠道中筛选到多株产淀粉酶、产纤维素酶能力较强的细菌菌株，其中鉴定1株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），与罗宝龙（2018）、冯光志（2018）、王金燕（2018）等报道一致。筛选试验表明各产酶菌株在供试的筛选平板上能够产生明显的透明圈，该筛选方法适用于细菌产酶菌株的筛选。

3.2 菌株液体产酶测定 采用摇瓶发酵试验进行了菌株的液体产酶能力测定，试验结果表明，培养条件为35℃，180 r/min，培养40 h时中温α-淀粉酶活力可达89.47 U/mL，培养48 h时CMC酶活力可达65.63 U/mL，摇瓶液体产酶能力较强，虽然与工业菌种相比有所差距，但从拓展菌种类型、丰富产品选择的角度考虑，也具备工业开发的潜力，后续将针对菌种培养及产酶工艺参数进行优化。

3.3 贝莱斯芽孢杆菌的应用 研究表明，贝莱斯芽孢杆菌能够产生丰富的次级代谢产物，能够促进作物生长，抑制多种植物病原菌，如Bacillus velezensis9912D在2016年已被批准成为新型杀菌剂，用来防治茄果类灰霉病、棉花枯萎病、苹果树腐烂病、晚疫病等植物病害。贝莱斯芽孢杆菌不仅仅存在于土壤中，近年来越来越多关于从动物肠道中分离出贝莱斯芽孢杆菌的相关报道，贝莱斯芽孢杆菌具有产木质纤维素降解酶、淀粉酶、蛋白酶等多种产酶特性，又可用于霉菌毒素解毒和饲料基质生物修复，其在食品、动物饲料、纺织、造纸、生物燃料、农业废弃物处理等领域都具有潜在的应用价值（陈龙，2020）。本试验所筛选到的菌株CY-03具备较强的产淀粉酶和纤维素酶能力，且对生物安全性较高，应用潜力较大，后续将对该菌株的功能和代谢产物类型进行更深入研究。

4 结论

本研究通过淀粉培养基和羧甲基纤维素钠培养基从AA+白羽肉鸡肠道中分离筛选到1株高产淀粉酶和纤维素酶的细菌菌株CY-03，经形态学和分子生物学鉴定，确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

通过液体产酶试验和生物安全性试验考察菌株的应用潜力，结果表明菌株CY-03具有高产淀粉酶和纤维素酶的特性，液体酶活分别为89.47 U/mL和65.63 U/mL，菌株具备明显的工业应用价值。以斑马鱼为宿主进行高浓度菌液饲养试验，结果表明菌株生物安全性较高，在生物饲料领域具有较好开发潜力。