复方醋酸氟轻松酊的体外透皮吸收实验研究

梁国栋，陈美玲，张 婷，刘卫东*

(1. 内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010；2. 湖南省药物安全评价研究中心，湖南 长沙 410331；3. 内蒙古大唐药业股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010010)

皮肤病是人类最常见的疾病之一，根据目前报告，已有近2000个病种，临床表现多种多样。除了系统性治疗外，外用药物是皮肤病治疗的主要方法。临床上对于外用药物的治疗原则主要有选择合理剂型，注意年龄、性别和部位，以及重视不良反应[1]。因此，对于外用药的研究要注重疗效的同时也要避免不必要的不良反应。

复方醋酸氟轻松酊曾用名是皮炎宁酊，是肾上腺皮质激素类药。适用于神经性皮炎，对银屑病也有一定疗效，因其价格低廉，使用方便，作为外用制剂在临床上应用广泛[2]。复方醋酸氟轻松酊是由醋酸氟轻松、水杨酸、冰片、甘油、二甲基亚砜、乙醇和适量的水组成。其中醋酸氟轻松具有较强的抗炎抗过敏作用，可缓解红肿热痛症状[3]，冰片局部擦用后有止痛、抗菌作用，间苯二酚能杀灭细菌和真菌，同时也有止痒和溶解角质的作用[4]。姜文霞等[5]提出，醋酸氟轻松在酸、碱、高温条件下易降解成游离醋酸氟轻松降解产物，影响复方醋酸氟轻松酊在皮肤的滞留和吸收，对治疗效果造成影响或增加全身暴露的不良反应的风险。通过我们前期研究发现，当调整皮酊的工艺，可以减少杂质的产生。为了更好的探究模拟实际情况，需要开展体外透皮实验进一步验证。采用Franz扩散池，选取与人体皮肤穿透性特征最近的巴马小型猪皮为模型[6-7]，测定复方醋酸氟轻松酊中间苯二酚、水杨酸、醋酸氟轻松及醋酸氟轻松降解产物的累积透过量、皮肤剩余量和皮肤滞留量，探究不同工艺条件受试酊剂透皮行为的一致性，并考察含有不同浓度醋酸氟轻松的受试酊剂透皮行为的差异性，为产品的安全性和有效性评价提供数据支持。

1 仪器与材料

TK-24BL型透皮扩散试验仪(上海铠凯科技贸易有限公司)，LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津有限公司)，AUW220D型分析天平(日本岛津有限公司)，Legend TM MACH 1.6/R型台式高速冷冻离心机(美国Thermo)，Sigma 1-14 离心机(德国 Sigma)，KQ-300E超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)。

受试酊剂工艺1(批号：1701122201)，受试酊剂工艺2(批号：1801090302)，受试酊剂工艺3(同受试酊剂工艺2处方中加入12%的醋酸氟轻松降解物,批号：1801090303)，三种受试酊剂处方执行国家处方标准(国药准字H15021088)。

醋酸氟轻松标准物质(中国食品药品检定研究院，批号：100010-201108，纯度100.0%)，醋酸氟轻松降解物对照品(自制，纯度99.9%)，间苯二酚标准物质(中国食品药品检定研究院，批号：100389-201202，纯度99.9%)，水杨酸原料药(中国食品药品检定研究院，批号：100106-201605，纯度99.7%)，甲醇(TEDIA，批号：15055025，色谱纯)，乙腈(SIGMA，批号：WXBC1009V，色谱纯)，甲酸(德国CNW，批号：L401K140，色谱纯)，磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20150801，色谱纯)，无水乙醇(天津光复精细化工研究所，批号：20161025，分析纯)。

巴马小型猪离体皮肤，泰州泰和生物科技有限公司提供，实验动物合格证编号：SYXK(湘)2015-0016。

2 方法与结果

2.1 离体猪皮肤经皮渗透试验

利用Franz扩散池，将猪皮固定在供给池与接收池之间，角质层面向供给池一侧，供给池中加入复方醋酸氟轻松酊剂0.1mL，接收池中加入8mL的接收液(含5%乙醇的生理盐水)，接收池底部凹槽中放入磁力搅拌子，搅拌速度200rpm，温度37℃±0.2℃，于2、3、4、6、8h定时取样，每次吸取0.9mL接收液，随即补加等体积同温度的接收液，8h后终止试验。三批次(批号1701122201、1801090302、1801090303)复方醋酸氟轻松酊分别平行操作6份。利用HPLC测定接收液样品醋酸氟轻松、醋酸氟轻松降解产物、间苯二酚、水杨酸的浓度。

2.1.1含量测定的色谱条件

醋酸氟轻松降解物、间苯二酚、水杨酸的色谱条件。色谱柱：Venusil ASB C18(50×4.6mm，5μm)；保护柱：phenomenex C18(4.0×3.0 mm，5μm)；流动相：A相：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇—乙腈溶液(5：1，v/v)；按表1进行梯度洗脱：流速：0.7mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。检测波长：240(间苯二酚)、270nm(水杨酸、醋酸氟轻松降解物、醋酸氟轻松)。

表1 醋酸氟轻松降解物、间苯二酚和水杨酸接收液的梯度洗脱程序

醋酸氟轻松的色谱条件。色谱柱：Venusil ASB C18(50×4.6mm，5μm)；保护柱：phenomenexC18(4.0×3.0mm，5μm)；流动相：A相：0.1%磷酸水溶液：B相：甲醇乙腈溶液(5∶1，v/v)=35∶65；流速：0.85mL/min；柱温：40℃；检测波长：240nm；进样量：10μL。

2.1.2溶液的配制

储备液的制备：精密称取醋酸氟轻松标准物质8.00mg，置于10.0mL棕色容量瓶，加甲醇适量，使其溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为800mg/L的醋酸氟轻松储备溶液，2℃～10℃保存；精密称取醋酸氟轻松降解物对照品8.00mg，置于10.0mL棕色容量瓶，加甲醇适量，使其溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为800mg/L的醋酸氟轻松降解产物储备溶液，2℃～10℃保存；精密称取水杨酸标准物质40.00mg，置于5.0mL棕色容量瓶，加甲醇适量，使其溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为8000mg/L的水杨酸储备溶液，2℃～10℃保存；精密称取间苯二酚标准物质40.00mg，置于5.0mL棕色容量瓶，加甲醇适量，使其溶解后定容至刻度，摇匀，即得浓度为8000mg/L的间苯二酚储备溶液，2℃～10℃保存。

空白接收液的制备：将猪皮固定在供给池与接收池之间，角质层面向供给池一侧，供给池中加入基质辅料，接收池中加入8mL接收液，接收池底部凹槽中放入磁力搅拌子，搅拌速度200rpm，温度37℃±0.2℃，8h试验结束后取出全部接收液，即得空白接收液。

接受液标准溶液曲线的配制：精密移取醋酸氟轻松(800mg/L)、醋酸氟轻松降解物对照品(800mg/L)、水杨酸(8000mg/L)、间苯二酚储备液(8000mg/L)各65.0μL置于EP管中，加空白接收液740.0μL，涡旋15s，得醋酸氟轻松、醋酸氟轻松降解物对照品、水杨酸、间苯二酚浓度分别为52、52、520、520mg/L的混合标准溶液，用空白接收液逐级稀释，得含醋酸氟轻松和醋酸氟轻松降解物对照品浓度分别为32、16、8、4、2.4、1.2mg/L及含水杨酸和间苯二酚浓度分别为320、160、80、40、24、12mg/L的系列混合标准溶液。精密移取醋酸氟轻松(800mg/L)36.0μL置于EP管中，加空白接收液764.0μL，涡旋15s，得醋酸氟轻松浓度为36mg/L的标准溶液，用空白接收液逐级稀释，得含醋酸氟轻松为24、16、8、4、2、1mg/L系列标准溶液。分别绘制醋酸氟轻松、醋酸氟轻松降解物、水杨酸和间苯二酚的标准溶液曲线。

醋酸氟轻松的回归方程为：A=26497.6c+990.987，R=0.9993857，线性范围为1～36mg/L；

醋酸氟轻松降解物的回归方程为：A=25336.5c-3188.42，R=0.9996386，线性范围为1.2～52mg/L；

水杨酸的回归方程为：A=A=44395.5c+62797.9，R=0.9961814，线性范围为12～520mg/L；

间苯二酚的回归方程为：A=2538.38c+2169.12，R=0.9993312，线性范围为12～520mg/L。

2.1.3结果

根据HPLC的得出的各物质浓度计算累积透过量。计算公式如下：

其中Cn为取样时药物在接收液中的浓度(mg/L)；V为接收液的体积(8mL)；Ci为第i点测定的接收液药物的浓度(mg/L)；Vi为每次取样体积(0.9 mL)；S为有效透过面积(3.14cm2)。

3批次复方醋酸氟轻松酊剂的累积透过量如图1所示，经离体猪皮透皮8 h后均未能检测出醋酸氟轻松降解物和醋酸氟轻松，表明醋酸氟轻松降解物和醋酸氟轻松不经皮吸收。受试酊剂1和受试酊剂2中的间苯二酚和水杨酸在离体猪皮中的累积透过量比较，均无统计学差异。受试酊剂2和受试酊剂3中的间苯二酚和水杨酸在离体猪皮中的累积透过量比较，均无统计学差异。因此不同的工艺以及外加醋酸氟轻松降解物对酊剂的累积透过量没有影响。

图1 复方氟轻松酊剂经皮透过药物累积透过量(A)醋酸氟轻松(B)醋酸氟轻松降解物(C)间苯二酚(D)水杨酸

2.2 离体猪皮肤表面剩余酊剂含量测定试验

8h后终止复方醋酸氟轻松酊离体猪皮肤渗透试验后，用适量甲醇洗涤皮肤，合并洗液至1.0mL棕色容量瓶，定容至刻度，摇匀，即得皮肤表面剩余酊剂样品。取皮肤表面剩余酊剂样品用甲醇稀释(1701122201、1801090302、1801090303稀释倍数分别为1、2、2)倍后取100μL 12000rpm离心5min取上清进样分析，测定醋酸氟轻松和醋酸氟轻松降解物的含量；取皮肤表面剩余酊剂样品用甲醇稀释10倍，取100μL 12000rpm离心5min取上清进样分析，测定间苯二酚和水杨酸的含量。皮肤用滤纸吸干表面溶剂，置于2℃～10℃保存，待测。

2.2.1含量测定的色谱条件

色谱柱：Venusil ASB C18(50×4.6mm，5μm)；保护柱：phenomenex C18(4.0×3.0 mm，5 μm)；流动相：A相：0.1%甲酸水溶液，B相：甲醇—乙腈溶液(5∶1，v/v)；按表2梯度洗脱：流速：0.7mL/min；柱温：40℃；检测波长：240nm(间苯二酚)、270nm(水杨酸、醋酸氟轻松降解物对照品、醋酸氟轻松)；进样量：10μL。

表2 提取液的梯度洗脱程序

2.2.2溶液的配制

标准储备液配制方法同2.1.2。

标准溶液的配制：精密移取醋酸氟轻松(800mg/L)、醋酸氟轻松降解物(800mg/L)各250.0μL，水杨酸(8000mg/L)、间苯二酚储备液(8000mg/L)各50.0μL置于EP管中，加甲醇400.0μL，涡旋15s，得醋酸氟轻松、醋酸氟轻松降解物、水杨酸、间苯二酚浓度分别为200、200、400、400mg/L的混合标准溶液，用空白提取液逐级稀释，得含醋酸氟轻松和醋酸氟轻松降解物浓度分别为60、15、7.5、3、1、0.5mg/L及含水杨酸和间苯二酚浓度分别为120、30、15、6、2、1mg/L的系列混合标准溶液。

醋酸氟轻松的回归方程为：A=31841.2c-752.221，R=0.9956733，线性范围为0.5～200mg/L；

醋酸氟轻松降解物的回归方程为：A=28678.4c-1086.39，R=0.9958931，线性范围为0.5～200mg/L；

间苯二酚的回归方程为：A=13897.3c+730.058，R=0.9963120，线性范围为1～400mg/L；

水杨酸的回归方程为：A=44143.5c+6564.98，R=0.9995123，线性范围为1～400mg/L。

2.2.3结果

按“2.2”项下所述方法制备皮肤表面剩余酊剂样本，进液相分析间苯二酚、水杨酸、醋酸氟轻松、醋酸氟轻松降解物的浓度。皮肤用滤纸吸干表面溶剂，置于2℃～10℃保存，待测。计算皮肤表面剩余量结果如图2所示：1701122201、1801090302、1801090303三个批号醋酸氟轻松(Mean±SD)分别为：6.854±0.584、13.292±0.512、13.777±0.425 ±g；醋酸氟轻松降解物(Mean±SD)分别为：2.068±0.170、3.950±0.128、4.001±0.136μg；间苯二酚(Mean±SD)分别为：3 430.715±182.292、3 619.303±204.211、3 485.035±110.507μg；水杨酸(Mean±SD)分别为：1752.543±98.363、1828.032±83.924、1759.510±49.080μg。

图2 复方氟轻松酊剂皮肤剩余量(A)醋酸氟轻松(B)醋酸氟轻松降解物(C)间苯二酚(D)水杨酸

2.3 离体猪皮肤滞留量试验

仔细剪掉皮肤周边非有效透过面上的皮肤，将含药皮肤，剪碎成约1mm见方的小颗粒，置EP管中，第一次用2mL甲醇提取后定容至2.0mL棕色容量瓶，取100μL12000rpm离心5min取上清进样分析，利用HPLC法测定醋酸氟轻松降解物的含量；第二次用2mL甲醇及第三次用4mL甲醇提取后，合并前三次提取液定容至10.0mL棕色容量瓶，取100μL12000rpm离心5min取上清进样分析，用HPLC法测定醋酸氟轻松的含量；第四次用4mL甲醇、第五次用8mL甲醇及第六次用8mL甲醇提取后，合并前六次提取液定容至50.0mL棕色容量瓶，取100μL12000rpm离心5min取上清进样分析，利用HPLC测定水杨酸和间苯二酚的含量。

2.3.1含量测定的色谱条件

色谱条件如2.2.1。

2.3.2溶液的配制

标准储备液配制方法同2.1.2。

空白提取液的制备：取基质辅料透皮后的皮肤，轻轻吸取角质层面上基质辅料，用适量甲醇洗涤3次，用滤纸吸干皮肤表面溶剂，置于2～10℃保存。取出皮肤，仔细剪掉皮肤周边非有效透过面上的皮肤，将含药皮肤剪碎成约1mm见方的小颗粒，置EP管中，加2mL甲醇超声10min、第二次加2mL甲醇超声10min、第三次加4mL甲醇超声10min、第四次加4mL甲醇超声10min、第五次加8mL甲醇超声10min、第六次加8mL甲醇超声10min，合并6次提取液至50.0mL棕色容量瓶并定容，即得空白提取液。

标准溶液的配制：精密移取醋酸氟轻松(800mg/L)、醋酸氟轻松降解物(800mg/L)各250.0μL，水杨酸(8000mg/L)、间苯二酚储备液(8000mg/L)各50.0μL置于EP管中，加空白提取液400.0μL，涡旋15s，得醋酸氟轻松、醋酸氟轻松降解物、水杨酸、间苯二酚浓度分别为200、200、400、400mg/L的混合标准溶液，用空白提取液逐级稀释，得含醋酸氟轻松和醋酸氟轻松降解物浓度分别为60、15、7.5、3、1、0.5mg/L及含水杨酸和间苯二酚浓度分别为120、30、15、6、2、1mg/L的系列混合标准溶液。

醋酸氟轻松的回归方程为：A=34222.5c-758.699，R=0.9964425，线性范围为0.5～200mg/L；

氟轻松的回归方程为：A=56251.4c-19.7964，R=0.9975570，线性范围为0.5～200mg/L；

间苯二酚的回归方程为：A=16377.7c+1160.71，R=0.9970047，线性范围为1～400mg/L；

水杨酸的回归方程为：A=51009.0c+12542.0，R=0.9969745，线性范围为1～400mg/L。

2.3.3结果

按“2.3”项下所述方法制备提取液样本，利用HPLC测定皮肤滞留药物浓度，根据药物浓度按照如下公式计算皮肤中的药物滞留量：

药物滞流量=VCt/S

其中Ct为t时间皮肤样品处理后测得的浓度(mg/L)，V为皮肤萃取后稀释的体积(mL)，S为有效透过面上的皮肤面积(3.14cm2)。

3批次的复方醋酸氟轻松酊药物滞留量结果如图3所示，受试酊剂1和受试酊剂2中的间苯二酚和水杨酸在离体猪皮中的皮肤滞留量比较，均无统计学差异，而受试酊剂1中的醋酸氟轻松在离体猪皮中的皮肤滞留量显著高于受试酊剂2(P≤0.01)。受试酊剂2和受试酊剂3中的醋酸氟轻松、间苯二酚和水杨酸在离体猪皮中的皮肤滞留量比较，均无统计学差异。对于醋酸氟轻松降解物的滞留量，受试酊剂1中6份平行样中有3份能提取到醋酸氟轻松降解物，受试酊剂2中6份平行样中有1份能提取到醋酸氟轻松降解物，受试酊剂3中6份平行样中有6份能提取到醋酸氟轻松降解物。说明受试酊剂1和2中均有醋酸氟轻松降解物的情况发生，且受试酊剂1降解情况较受试酊剂2严重。

图3 复方氟轻松酊剂皮肤滞留量(A)醋酸氟轻松(B)醋酸氟轻松降解物(C)间苯二酚(D)水杨酸

2.4 物质平衡

试验酊剂在离体猪皮上完成8h透皮试验后，收集接收液、皮肤提取液和皮肤表层残留酊剂，分别测定其中药物含量，与给药量比较，计算总体回收率。醋酸氟轻松和醋酸氟轻松降解物、间苯二酚以及水杨酸的回收率结果如表3、4、5所示。

表3 复方醋酸氟轻松酊剂中醋酸氟轻松+醋酸氟轻松降解物总体回收率

表4 复方醋酸氟轻松酊剂中间苯二酚的总体回收率

表5 复方醋酸氟轻松酊剂中水杨酸的总体回收率

3批试验酊剂(批号1701122201、1801090302、1801090303)中间苯二酚的回收率分别为75.45%±6.75%，75.62%±8.06%，69.64%±5.68%；水杨酸的回收率分别为90.94%±8.76%，91.43%±9.12%，80.45%±10.66%；醋酸氟轻松+醋酸氟轻松降解物的回收率分别为80.38%±9.32%，74.58%±9.78%，77.54%±12.02%。3批试验酊剂各物质的回收率相差小于15%，说明实验操作平行性较好。

3 讨论

通过对复方醋酸氟轻松酊剂受试酊剂工艺1和受试酊剂工艺2以及受试酊剂工艺3同配方工艺2中加入12%的醋酸氟轻松降解物进行离体猪皮透皮实验，8h后均未检测到氟轻松和醋酸氟轻松，表明氟轻松和醋酸氟轻松不经皮吸收。因此推断复方醋酸氟轻松酊可能通过皮肤外用发挥药效。其中受试酊剂工艺1和受试酊剂工艺2中的间苯二酚和水杨酸在离体猪皮中的皮肤滞留量比较，均无统计学差异；但受试酊剂工艺1中的醋酸氟轻松成分在皮肤中的滞留量显著高于受试酊剂工艺2，所以受试酊剂工艺1和受试酊剂工艺2透皮行为具有差异性，表明降解产物对受试酊剂中醋酸氟轻松在离体猪皮中的皮肤滞留有较大影响；受试酊剂2和受试酊剂3中的醋酸氟轻松降解物、间苯二酚和水杨酸成分在离体猪皮中的皮肤滞留量比较，均无统计学差异。

本研究考察了复方醋酸氟轻松酊的体外经皮渗透特性，结果显示，降解产物不同会影响受试酊剂主要成分醋酸氟轻松的皮肤滞留量，从而导致受试酊剂的透皮行为具有差异性，为复方醋酸氟轻松酊进一步安全性和有效性评价提供数据支持，也为产品稳定性研究提供思路。