急性肝衰竭大鼠肝星状细胞内质网应激调节HGF表达实验研究

蓝远强 吴发胜 黄丽珍 梁敏

肝细胞内存在大量内质网，内质网应激(ERS)参与急性肝衰竭(ALF)的发生发展[1-3]。肝细胞生长因子(HGF)对ALF发生后肝脏组织细胞的修复再生具有重要意义[4]。有研究认为ERS可能通过影响HGF延缓ALF，但尚缺乏足够证据[5]，目前临床有关ALF患者ERS与肝星状细胞HGF关系的报道也较为罕见。本研究通过大鼠模型基础实验，探讨ERS与HGF的关系及其相互作用的具体机制。

资料与方法

一、实验试剂

SD大鼠鼠龄3～4 w，体质量为180～240 g。脂多糖(LPS，货号Sigma L2880)和衣霉素(货号MS0013-1MG)均由上海懋康生物科技有限公司提供。D-氨基半乳糖(D-GaIN)由湖北赛搏医药化学品有限公司提供，4-苯基丁酸钠(4-PBA)由美国Sigma公司提供。

二、ALF建模

常规喂养SD大鼠1 w。完成后将60只大鼠随机分为A、B、C三组，每组20只。先通过腹腔注射给予D-氨基半乳糖 400 mg/kg、脂多糖 20 μg/kg。在注射完成1 h后给予A、C组大鼠0.6 mL/kg衣霉素，C组在完成上述操作后再注射4-PBA 500 mg/kg。在注射脂多糖后0 h(T1)、2 h(T2)、8 h(T3)和12 h(T4)时，各组分别处死5只动物，留取尾静脉血，离心取上清，备用。

三、检测方法

采用ELISA法检测血清HGF，试剂盒由南京卡米洛生物工程有限公司提供；检测肝组织HGF mRNA(武汉优博生物技术有限公司)。引物设计见表1。

表1 引物序列

四、RNA慢性病毒载体构建

设计并合成eIF2α-shRNA，另以NC-shRNA为阴性对照，序列分别为5′-GTACAAGAGACCTG-GATAT-3′和5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。两组分别记为eIF2α敲除组和阴性对照组。采用GV248载体，依次进行连接、转化、鉴定及共转染处理，完成后8 h替换为完全培养基，常规条件下继续培养2 d，收集上清液，进行浓缩处理后，再行滴度检验。在病毒感染3 d后收集细胞，提取蛋白，行荧光定量聚合酶链式反应检查，收集结果。

五、统计学分析

结 果

一、各组HGF表达

在T1时，三组HGF表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)；在T2、T3和T4时，A组血清HGF水平显著低于B组和C组，而C组显著低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组HGF表达(ng/mL)

二、三组HGF mRNA相对表达量比较

在T1时，三组SD大鼠HGF mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；在T2、T3及T4时，三组HGF mRNA相对表达量水平差异有统计学意义(P<0.05)。在T2、T3及T4时，A组SD大鼠HGF mRNA显著低于B、C两组，C组显著低于B组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 HGF mRNA相对表达量

三、eIF2α敲除组和阴性对照组HGF mRNA相对表达量比较

ERS时，eIF2α敲除组为0.4±0.2，显著低于对照组(1.6±0.3，t=7.442，P=0.000)。

讨 论

HGF作为肝组织再生调节因子，能加快组织增殖，促进血管生成，已被临床认可[6]。Hardesty等[7]认为HGF可刺激肝DNA合成。Liu等[8]基础实验也证实转染HGF基因后的肝硬化小鼠肝功能获得改善，ALF发生率显著降低。Holman等[9]研究还显示外源性HGF补充疗法可减轻ALF局部炎症，抑制肝病变进展。而与外源性补充HGF相比，通过转染增强HGF自分泌能力对促进肝细胞再生可能效果更好。尤其对于ALF患者，可能更有助于保护肝功能，降低病死率，改善预后。

既往报道证实c-Met受体可通过与HGF β链内丝氨酸蛋白酶样结构结合，进而激活蛋白酪氨酸激酶，最终将信号传至细胞核内，从而促进细胞增殖作用[10]。内质网是具有膜蛋白合成、加工、折叠作用的膜结合细胞器。而ERS多发生于氧化应激、病毒感染等刺激后[11]。阿依西布·萨吾提等[12]报道发现ERS发生后对c-Met受体具有抑制作用。而4-PAB是目前临床广泛使用的ERS抑制剂[13]。因而，本研究采用ALF大鼠模型，给予A、C两组衣霉素干预，诱导ERS发生，并给予C组ERS抑制剂4-PAB作为对照观察，结果显示A、C两组T2、T3及T4时HGF低于B组，而A组血清HGF和HGF mRNA相对表达量低于C组，提示ERS抑制剂干预有助于抑制HGF的下降趋势。因而，ERS对肝星状细胞HGF具有调控作用，进而参与病理进程。

eIF2α是由端结构域、螺旋结构域及α-β结构域组成的翻译起始因子，在蛋白激酶样内质网激酶通路发挥生物学作用中起关键作用[14]。研究还发现eIF2α磷酸化过程可激活转录因子4和未折叠蛋白反应相关基因转录，降低内质网内未折叠蛋白堆积，进而改善细胞内环境[15]。因此，eIF2α也被认为是ERS的标记。本研究也显示三组eIF2α蛋白相对表达量在T2、T3及T4各时点表达水平存在显著差异，说明eIF2α可能与ERS调控HGF过程有关。为此，本研究采用对照实验方法，通过重组慢病毒转染细胞，构建敲除eIF2α mRNA后的肝星状细胞，通过RT-PCR检查结果显示两组HGF mRNA水平差异显著，说明ERS可能通过影响eIF2α表达调控HGF水平，这可为今后ALF治疗提供新的靶向研究方向。

综上，ERS可通过影响HGF表达，参与ALF病理进程。