乳脂分离与检测分析技术研究进展

李墨翰 ，宋婉莹 ，于海坤，刘爱成，张秀敏，张 娟，郑 艳，岳喜庆

（1.沈阳农业大学食品学院，沈阳110161；2.北京食品科学研究院，北京100068）

脂质为一类疏水性或两性小分子，也是组成生物有机体最主要的成分之一。生物体内的各种生物过程都会导致脂质发生变化，如细胞增殖与凋亡、内外环境变化等[1]。反之，脂质的变化也会涉及与影响各种生物过程：例如脂质参与能量代谢、组成生物膜结构、以及作为信号分子参与信号通路的调控。哺乳动物细胞中含有超过一万种脂质[2]；血液中的代谢物大部分为脂质[3]。根据脂质基本骨架的差异，可将脂质分成八类，包括聚酮（polyketides，PK）、糖脂（saccharolipids，SL）、烯醇脂（prenol lipids，PR）、甾醇脂（sterol lipids，ST）、鞘脂（sphingolipids，SP）、甘油磷脂（glycerophospholipids，GP）、甘油脂（glycerolipids，GL）、脂肪酸（fatty acids，FA）[4]。要全面研究脂类在分子生物学中的作用和功能，就必须对脂类进行准确的鉴定和定量。近年来，随着脂质组学（lipidomics）技术的发展，大通量地对脂质进行表征与鉴定已经成为可能。脂质组学是使用大规模的高精度、高通量、快速的分析和检测技术方法，揭示揭示生物体内脂质的多样性及其对生理功能与代谢调控的影响[5]。早在21世纪初，脂质组学的概念便由HAN等[6]发明，其发明的基于质谱（mass spectrometry，MS）的鸟枪法（shotgun）脂质组学采用直接注入法将脂质输入质谱，从而对脂质进行鉴定。随后出现了基于高分辨率质谱进行数据采集的直接输注法，无需任何色谱分离即可直接完成脂质的鉴定和定量[7]。

乳中含有2%～5%的脂质。作为乳中主要的能量来源，乳脂能够提供哺乳动物新生儿所需能量的50%以上[8]。乳脂由乳腺上皮细胞分泌并以乳脂肪球的形式分散在乳中，其中大部分乳脂以甘油脂的形式存在于乳脂肪球内部（约98%），其余的小部分脂质（约2%），如甘油磷脂、鞘脂、糖脂等则主要分布在乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）上[9]。乳脂中甘油磷脂的总量很低（约0.4%～1%），但其对于促进哺乳动物新生儿的神经、大脑、视觉、肠道的发育具有不可或缺的意义，同时对于保持MFGM的结构也有不可或缺的作用[10]。目前鉴定到的乳脂主要包括大部分的甘油脂，以及少量的甘油磷脂、鞘脂、糖脂、甾醇脂等，乳中的甘油脂主要包括单甘脂（monoacylglycerol，MG）、甘油二酯（diacylglycerol，DG）、甘油三酯（triacylglycerol，TG）；乳中的甘油磷脂主要包括甘油磷脂酰胆碱（glycerophosphatidylcholine，PC）、甘油磷脂酰乙醇胺（glycerophosphatidylethanolamine，PE）、甘油磷脂酰甘油（glycerophosphatidylglycerol，PG）、甘油磷脂酸（glycerophosphatidic acid，PA）、甘油磷脂酰肌醇（glycerophosphatidylinositol，PI）、甘油磷脂酰丝氨酸（glycerophosphatidylserine，PS）、心磷脂（cardiolipin，CL）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysophosphatidylethanolamine,LPE）等脂质；乳中的鞘脂主要包括神经酰胺（ceramide，Cer）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、己糖神经酰胺（hexosylceramide，HexCer）、二己糖基神经酰胺（dihexosylceramide，Hex2Cer）等脂质。研究表明乳脂含有上千种脂质，是自然界脂质组成最复杂的物质之一。但是由于乳脂组成的复杂性以及脂质结构鉴定的困难性，目前仅在乳脂中鉴定出500余种脂质，仍有大量的乳脂有待表征与进一步鉴定[11]。因此，本研究综述了乳脂质组学常用的分离方法、检测与分析平台，以及适用于乳脂质组学的生物信息学分析途径，为深入研究乳脂质营养及配方乳粉的精细化研究提供理论基础。

1 乳脂的分离方法

20 世纪50 年代，FOLCH 等[12-13]分别建立了两种使用氯仿-甲醇作为有机相的液-液萃取法用于提取脂质，Folch 法适用于少量或组织中脂质的提取，提取率大约在95%～99%；而Bligh 法适用于大量脂类的提取，提取率大约在95%。上述两种方法是乳脂提取中使用最为广泛的方法，其操作简便，提取率较高。随后，MATYASH 等[14]发明了甲基叔丁基醚法用以脂质提取，LO¨FGREN 等[15]发明了使用丁醇提取脂质的方法。此外，固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）、超声辅助提取（ultrasonic-assisted extraction，UAE）、微波辅助提取（microwave-assisted extraction，MAE）、和超临界流体萃取（supercritical fluid extraction，SFE）也广泛用于乳脂的提取，并可实现乳脂的进一步分离及低丰度脂质进行选择性富集。然而，由于脂质分子结构复杂、种类繁多，当前的一些提取方法都很难完全提取脂质。在提取前可采取添加内标的方法，以定量分析和监测回收率。

1.1 甘油脂

甘油脂亦称甘油酯，指由甘油和脂肪酸（包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸）经酯化所生成的酯类，为中性脂。薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）为乳脂质组学研究领域中较为常用的脂质分离方法。TLC 法是一种使用吸附薄层色谱来达到分离目的的方法[16]。该方法使用硅胶作为吸附剂，以正己烷，乙醚和乙酸（或甲酸）为流动相进行萃取，操作较为简便且提取效率较高[17]，但是对于后续甘油脂的定量分析较为困难。

反相高效液相色谱（reversed-phase high-performance liquid chromatographic，RP-HPLC）也是乳中甘油脂分离的常用方法，主要包含极性流动相与非极性固定相[18]。由于甘油脂是弱极性化合物，几乎不溶于水，因此有机溶剂可增加甘油脂的溶解度。目前，适用于乳脂分析中RP-HPLC 的最常用的有机溶剂是丙酮和乙腈，最常用的固定相是十八烷基键合硅胶柱[11]。通过RP-HPLC分析甘油脂的峰，以碳原子当量数的顺序洗脱。该方法制备的色谱主柱效高、使用寿命长、重现性好，对于乳中的甘油脂呈现良好的选择性，同时能够应用于梯度洗脱操作，在一定程度上弥补分配色谱法的缺陷[11]。

高效液相色谱结合银离子交换柱（silver-ion high-performance liquid chromatographic，silver-ion HPLC）是分离乳脂中TG 异构体的最有效的色谱方法。采用silver-ion HPLC 方法时，TG 根据其组成脂肪酸的不饱和度从而进行分离，并且甘油三酯中双键的数目越大，保留时间越长[19]。乳脂中甘油三酯的分离顺序为：SSS、SSM、SMM、SSD、MMM、SMD、MMD、SDD、SST、MDD、SMT、MMT、DDD、SDT、MDT、DDT、STT、MTT、DTT、TTT（S、M、D和T 分别指饱和、单不饱和、包含两个双键以及包含3 个双键的脂肪酸）[20]。分离出的TG 异构体的峰顺序是：SMS、SSM、SMM、MSM、SDS、SSD、DSD、DDS、DMD、DDM[20]。

气相色谱（gas chromatography，GC）具有较高的稳定性和良好的准确性，但对于乳脂的分析仅适用于脂肪酸饱和度较高的样品。乳中较高不饱和度的TG 在高温下氧化裂解，相应的出峰顺序按照TG 的碳总数从小打大进行排列。目前，针对甘油脂的分析主要使用两种类型的填充剂，即非极性和中极性填料；前者可获得不同的碳总数TG，后者可针对单一TG种类进行鉴定。针对乳中甘油脂的分析常用的色谱柱为WCOT柱，即为涂有25M×0.25mM甲基苯基硅氧烷聚合物的熔融石英。乳脂中甘油三酯的分离顺序为：SSS、SSM、SSD、MMM、SDM、MMD、SDD、MDD、DDD、DDT[20]。

超临界流体色谱法（supercritical fluid chromatography，SFC）也是脂质分离较为常用的方法之一。与HPLC法相比，SFC 法的柱效更高，因此分离时间也比HPLC 法短。这是因为流体的低粘度使其流动速度比HPLC 法快，因此有效地缩短了分离时间。与GC法相比，由于流体的扩散系数与粘度介于气体和液体之间，因此SFC的谱带展宽更小小。另外，SFC 法的应用温度比GC 法更低，对于热不稳定性化合物及高聚物的分离更为有效。对于乳中甘油三酯的分离，SFC 法可以使用与GC 法相同的色谱柱，并可以添加一定的改性剂以实现更好的分离度，从而实现对于甘油三酯同分异构体的分离与鉴定。乳脂中TG 的分离顺序为：SMD、MMM、SDD、MMD、MMT、MDD、DDD、MDT、MTT、DDT、DTT[20]。

1.2 甘油磷脂

甘油磷脂指甘油的两个羟基和脂肪酸形成酯，第3个羟基被磷酸酯化所形成的的脂类，为极性脂。TLC 法是用于甘油磷脂分离的最早的方法之一，其操作简单快捷、对于磷脂纯度的要求较低，目前仍广泛应用于乳中甘油磷脂的分离。高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography，HPTLC）是对传统TLC法的升级和改进，也更适用于磷脂的分析[21]。HPTLC 法的固定相使用更加细密均匀的改性硅胶（modified silica gel）及纤维素，所选择的分离薄板的厚度也更低，因此相比于传统的TLC法的分离时间更短、分离效果更好[22]。目前，采用HPTLC 法对于磷脂的分离所选择展层剂多为氯仿/甲醇/水（25∶10∶1，V/V/V）[23]。由于HPTLC 法的样品与空气接触时间较长、接触面积较大，因此容易造成磷脂样品的水解或氧化，同时灵敏度与分辨率也较低。

固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）也是广泛应用于甘油磷脂的分离提取与富集的一种方法。相比于传统的液液萃取（liquid-liquid extraction，LLE）和蛋白沉淀法（protein precipitation，PPT），SPE 法所处理样品的批量更大、灵敏度更高，同时效率更高，重现性也较好[24]。BANNI 等[25]采用SPE 法使用氨基固相萃取柱（amino solid phase extraction column，ASPEC）对甘油磷脂进行分离，但发现使用ASPEC 存在部分甘油磷脂分子共洗脱的现象，且PI无法进行洗脱。PÉREZ-PALACIOS等[26]在ASPEC基础上增加了PS、PE、PC的洗脱机体积，并进一步替换了PI的洗脱溶剂，最终鉴定到PI、PS、PE、PC共计4类甘油磷脂。

亲水作用高效液相色谱法（hydrophilic interaction high-performance liquid chromatography，HIHPLC）能够较好地实现亲水性物质与极性物质的分离，也是甘油磷脂分离较为常用的方法之一。HIHPLC 法所使用的梯度和反相模式相反，其初始条件包括高比例有机相（如95%乙腈），并逐步降低到水相[27]。HIHPLC 法所使用的流动相与前面所描述的RP-HPLC 相似，与质谱的兼容性更好。同时，由于HIHPLC 法所使用的流动相为与水互溶的有机溶剂，因此也很好地改善了RP-HPLC存在的极性物质流动性差以及重现性较低的问题[28]。针对乳中甘油磷脂的分离，可使用氰基键合相（cyano bonded phase）、二醇基键合相（glycol bonded phase）、氨基键合相（amino bonded phase）、硅胶固定相（silica gel stationary phase）等与RP-HPLC 法所使用的的相同的固定相，也可以使用两性离子固定相（zwitterionic stationary phase）、醇羟基固定相（alcohol hydroxyl stationary phase）、酰胺固定相（amide stationary phase）等HIHPLC专用的固定相[29]。

1.3 鞘脂与糖脂

鞘脂类分子由3 个基本结构成份组成：一是鞘氨醇，是长链的带有氨基的二醇，链长约18 个碳原子；二是长链脂肪酸，链长约18～26 个碳原子，以酰胺键与鞘氨醇相结合，称为神经酰胺；三是极性基团的头部，通常联接在鞘氨醇第一个碳原子的羟基上。因极性基团不同，形成不同类型的鞘脂，含有磷酸的称为鞘磷脂，含有糖基的称为鞘糖脂。鞘糖脂分子中的糖基数目不等。仅含一个糖基的鞘糖脂统称脑苷脂。与甘油脂、甘油磷脂的检测方法类似，TLC 法也是最早应用于鞘脂及糖缀合物的定性分离检测[30]。对于鞘脂与糖脂的分析，TLC 法使用高浓度的酸和其他腐蚀性彩色显影剂进行显色，并具有设备结构简单、操作步骤方便、膨胀率高和分辨率高的优点，并且可以使用糖脂特异性显色试剂和抗体进行分离。在完成色谱分离后，也很容易消除非糖脂化合物的干扰并实现特异性检测。但是TLC 法对于某些复杂的鞘脂类物质的分离效果并不理想。相比于传统TLC法，HPTLC法所使用的基质硅胶颗粒具有更小的粒径和更好的均匀性，因此更适合于鞘脂与糖脂的分离检测[31]。为克服吸光度带来的影响，HPTLC法采用多级膨胀技术，并利用更小的基质硅胶颗粒增加单位面积样品的浓度，从而提高检测灵敏度[32]。HPTLC 法与质谱技术相结合有效地解决上述问题，采用HPTLC-MS 法可直接对脂质进行分离定量而无需进行纯化[33]。

正相高效液相色谱法（normal phase high performance liquid chromatography，NP-HPLC）可以实现鞘脂及糖脂等脂质的分离，但由于流动相的易挥发、难溶等特特点，因此容易造成保留时间的漂移，从而减低质谱的雾化效率[34]。于NP-HPLC 相比，RP-HPLC 法对于鞘脂与糖脂的分析更显逊色。RP-HPLC 在对鞘脂、糖脂等脂质进行分离检测时易出现分离度较差及峰重叠的问题，并在MS中导致离子抑制[35]。

HIHPLC 法能够较好地实现亲水性物质和极性物质的分离，因此常用与鞘脂、糖脂、甘油磷脂等物质的分离检测。与前面所描述的针对甘油磷脂的分离相同，针对鞘脂、糖脂等脂质时，HIHPLC 法硅胶为基质键合亲水性聚合物作为固定相，包括长链醚基（long chain ether groups）、聚酰胺（polyamide）、苯基（phenyl）、羟丙基（hydroxypropyl）、苄基（benzyl）等[36]。OKAZAKI等[37]采用HIHPLC法实现了甘油磷脂、鞘脂、糖脂等脂质的分离及检测，并对所鉴定到的100多种脂质的二级结构进行了进一步分析。

2 乳脂的检测及分析方法

2.1 电喷雾电离质谱法

电喷雾电离质谱法（electrospray ionization-mass spectrometry，ESI-MS）是一种广泛使用的软电离方法。在这种方法中，包含分析物的洗脱液通过高压针头喷射，然后将带电的液滴加热以蒸发溶剂，最后分析物形成气相离子以进行检测和分析[38]。根据原理的差异，ESI-MS法可分成3类：ESI-MS直接定量法、ESI-MS/MS定量法和HPLC-ESI-MS定量法[39]。FENN等[40]最先将ESI-MS法应用于大批量混合物的分析，这种方法可以使生物分子离子化而不会发生碎裂，有助于更好地分析混合物的样品。与其他方法相比，ESI-MS法具有预处理简单、分离度高和易于自动化操作的优点[43]。ESI法适用于极性、热力学稳定、非挥发性分子的分析，可以满足大多数脂质分析的要求，也适用于一些脂质混合物（例如甘油磷脂和混合物）的定性和定量分析。

鸟枪法脂质组学是由HAN 等[6]在ESI 法和三重四级杆串联质谱（triple quadrupole tandem mass spectrometry）的基础上发明的。三重四级杆串联质谱由3个四极质谱分析仪串联在一起，其中第1个（Q1）和第3个（Q3）四级质谱通常用作质量分离，而第2 个四极（Q2）质谱则通常用作作碰撞激活解离（collision-activated dissociation，CAD）的碰撞池。通过调整3 个四极杆的功能，可以实现产物离子扫描、前驱体离子扫描（precursor ion scan，PIS）、中性损失扫描（neutral loss scan，NLS）和选择性反应监测、多反应监测等选择功能[42]。基于ESI-MS/MS 的鸟枪法脂质组学技术具有准确度高、灵敏度高、重现性好、无需对复杂样品进行预处理等优点，在脂质组学研究中得到广泛应用。随后，YANG 等[43]在2009年开发了基于多维质谱的鸟枪法脂质组学（multidimensional mass spectrometry-based shotgun lipidomics，MDMS-SL），并又于 2019 年提出了色谱分离质谱法[44]。SOKOL 等[45]使用鸟枪法脂质组学技术对人乳、牛乳和婴儿配方乳粉中的脂质进行了分析，共鉴定出6 类共计136 种脂质，包括TG、PC、PE、PS、PI和SM，随后SOKOL等[45]又采用GC法对乳脂中的脂肪酸进行补充研究，共表征并定量了16种碳原子数在10～20之间的脂肪酸。考虑到乳脂基质中包含数千种脂质及大量的同分异构体，而色谱分离被认为是避免离子抑制和区分同分异构体的关键，因此鸟枪法常用于蛋白、多糖等生物大分子的研究，而对乳脂中大量脂质的表征不够全面。

2.2 基质辅助激光解吸电离质谱法

基质辅助激光解吸电离质谱法（matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry，MALDI-MS）是脂质组学方法常用的软电离方法之一。MALDI-MS法通过将样品与基质混合并将激光能量通过基质转移到样品来测量分子的电离情况，同时，MALDI-MS 的离子源通常与飞行时间质谱仪（time-of-flight mass spectrometer，TOF-MS）结合使用，该方法反应快速，方便可重现，并可以实现对高通量物质的快速表征[53]，因此广泛用于乳制品中的掺假鉴定[48]。GARCIA 等[49]使用MALDI-QTOF MS 实现了对牛乳粉及掺假牛乳粉中甘油脂的快速表征，最终鉴定到20 种TG；对羊乳及掺假羊乳中的磷脂进行快速鉴定，最终识别到5 类共计45 种磷脂，包括PC、LPC、PE、SM、PI[50]。尽管MALDI-MS 具有较高的灵敏度和分析通量，但在MALDI-MS 图谱中通常无法找到质子化后的磷脂分子[M+H]+。因此,MALDI-MS是鉴定某些脂质种类中脂肪酸组成的较为快速与便捷的方法，但是对两种不同类型的磷脂进行定量分析则较为困难[11]。同时由于MALDI-MS 电离模式受基质的影响很大，因此必须找到合适的基质来辅助样品的电离，以实现更好的重现性和可比性。YENER 等[51]使用银离子固相萃取与MALDI-TOF-MS 结合的方法，对无水牛乳及干法分馏获得的不同熔点馏分中的甘油三酯进行表征，最终鉴定到81种甘油三酯；CALVANO 等[52]使用带有二氧化钛微柱的微固相萃取与MALDI-TOF-MS 结合的方法对牛奶、巧克力牛奶和黄油中的磷脂进行快速分析，最终鉴定出3类共计24种磷脂，包括SM、PC 和PE。因此,在使用MALDI-MS对乳脂进行表征时，最好选择合适的基质来辅助样品的电离，从而实现更加准确的定性与定量。

2.3 核磁共振波谱法

核磁共振波谱法（nuclear magnetic resonance spectroscopy,NMR）也是乳脂质组学指纹图谱分析较为常用的方法。相比于其他方法，NMR 法可以直接提供样品中某一特定原子的各种化学状态或物理状态，并可得到它们各自的定量数据，而这些数据并不需要纯物质的校正，谱带下的面积直接与提供这种面积的原子核数量成正比。同时，NMR法可用于混合样品的直接检测，具有不破坏样品及高重复性的优点。BOCCIA等[53]使用NMR法对不同饲喂条件下山羊奶的脂肪酸组成进行了分析，并发现在山羊补充亚麻籽饮食后，其乳脂中共轭亚油酸（conjugated linoleic acid，CLA）的质量浓度较高；TSIAFOULIS等[54]使用NMR法对普通牛奶和有机牛奶的乳脂进行对比分析，发现有机牛奶中的共轭亚油酸、α-亚麻酸等不饱和脂肪酸的含量显著增加；KLEIN 等[55]对酮症与健康奶牛的乳脂进行对比分析，发现乳中甘油磷酸胆碱与磷酸胆碱的比例可作为奶牛酮症风险的生物标志物；GARCIA 等[56]采用NMR 法对不同乳源（牛乳、人乳、马乳、骆驼乳）中的磷脂进行对比研究，共鉴定到12个亚类，包括LPA、LPE、PA、CL、磷脂酰乙醇胺缩醛磷脂（phosphatidylethanolamine plasmalogen，EPLAS）、PE、SM、PS、LPC、PI、烷基酰基磷脂酰胆碱（alkyl-acyl phosphatidylcholine，aaPC）、PC，并发现人乳和骆驼乳中鞘磷脂和缩醛磷脂的总含量较高。但是，NMR 法对于复杂化合物的定性及定量分析能力是有限的，因此其灵敏度与质谱相比较差且通常应用于非选择性分析。

2.4 气相色谱-质谱法

气相色谱-质谱法（gas chromatograph-mass spectrometry，GC-MS）是脂质组学分析中较为常用且操作较为便捷的方法之一，大多数用于检测挥发性化合物或可衍生成挥发性的化合物，在乳脂质组学分析中常用与脂肪酸的检测和分析。例如，本课题组使用基于GC-TOF-MS 的脂质组学技术，对不同泌乳期驴乳的游离脂肪酸（free fatty acid，FFA）进行对比研究，共鉴定到24种FFA，并发现其中11种FFA的表达量存在显著差异[57]；JONG等[58]使用GC-MS 对牛乳和奶酪中的FFA 进行分析，共鉴定到11 种FFA，包括10 种饱和FFA（C2∶0～C18∶0）和1种单不饱和FFA（C18∶1）；CHUANG 等[59]基于GC-MS法对母乳和婴幼儿配方乳中的FFA进行对比研究，共鉴定到16 种FFA，包括8 种饱和 FFA（C10∶0～C24∶0），2 种单不饱和 FFA（C16∶1，C18∶1）和 6 种多不饱和 FFA（C18∶3n-3，C18∶2n-6，C20∶4n-6，C20∶5n-3，C20∶3 和 C22∶6n-3）。JAMES 等[60]最先将GC 法引入到脂肪酸的检测中，并使用极性毛细管柱（如DB-Wax 或INNOWax）用于分析检测。通过将质谱连接到GC 作为其检测器，能够大幅提高检测的灵敏度。GC-MS 作为脂质组学分析的重要工具之一，具有良好的分离效率且价格相对低廉。GC-MS 分析前样品制备的步骤通常包括脂质的预分离、水解、衍生化或热分解[61]。由于GC-MS 只能分析挥发性有机物，对于非挥发性脂质，必须先用磷脂酶C（phospholipase C）水解后才能进行分析。水解后的产物通常包括FFA、水溶性产物（皂化部分）和一些非极性、非皂化的成分[62]。在衍生化的过程中，通常采用硅烷化或甲酯化的方式来提高脂质的挥发性，以便进一步分析[63]。然而，在实际的GC-MS 分析过程中的脂肪酸为已经酯化后的脂肪酸，因此无法获得脂质sn-1 和sn-2 酰基脂肪酸链的位置信息[64]。另外，由于样品衍生化过程不仅需要额外的时间，而且需要大量的样品，样品在这个过程中也极容易发生变化。由于上述这些问题，GC-MS法在实际应用中只用于相对简单的脂肪酸的分析和鉴定，而较少用于对复杂脂质分子及其结构的鉴定。

2.5 高效液相色谱-质谱法

高效液相色谱-质谱法（high-performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）是目前乳脂质组学研究中使用最广泛、灵敏度最高的研究方法，并常用与靶向及非靶向分析。在HPLC-MS 分析之前需要对脂质进行提取，BLIGH 等[65-66]发明的方法是目前HPLC-MS分析中使用最广泛的脂质提取方法。另外也可以添加一些抗氧化剂，如丁基化羟基甲苯（butylated hydroxytoluene）等，可以避免脂质在提取前的氧化[67]。在进行HPLC-MS 分析之前，通常使用蒸发的方式来除去萃取剂（氯仿/甲醇），并且在与LC 流动相适应的不同溶剂系统中重建脂质[68]。为提高HPLC-MS 分析的准确性和灵敏性，通常在提取前添加包括每种亚类脂质的内标[69]。此外，为提高脂质组学分析数据的质量并提高鉴定脂质的数量，通常在HPLC-MS 分析之前使用SPE 色谱柱或TLC 对样品进行预清洗或预分离[11]。可选择的用于脂质组学分析的脂质分离的液相色谱有很多，包括银离子液相色谱（silver-ion-LC）、手性液相色谱（chiral LC）、超临界流体液相色谱（supercritical fluid LC）、离线二维液相色谱（off-line 2-D LC）、正相液相色谱（NP-LC）、反相液相色谱（RP-LC）和亲水相互作用液相色谱（HI-LC）等。质谱分析仪则主要包括四极杆-飞行时间（quadrupole-time of flight，Q-TOF）质谱、串联四级杆复合线性离子阱（series quadrupole composite linear ion trap，Q-Trap）质谱、三重四级杆（triple quadrupole，QQQ）质谱、傅立叶变换离子回旋共振（fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR）质谱等。HPLC-MS 不仅可以确定乳脂的种类和每种脂种类的脂肪酸组成，在某些条件（不同的电离技术）下还可以确定脂肪酸的区域特异性位置，并提供有关脂质类别和单个脂质的定量信息[11]。与GC-MS 法相比，HPLC-MS 法更适用于对长链及较难挥发的脂质的定性及定量分析；与NMR法相比，HPLC-MS法在定量及次级代谢物分析方面具有优势。本课题组使用基于UHPLC-QTOF-MS 的脂质组学技术对不同泌乳期驴乳与牛乳进行研究，共鉴定到13 个亚类共计335 种脂质，包括CL、PA、PC、PE、PG、PI、PS、Cers、SMs、HexCers、Hex2Cers、DG、TGs[70-71]；WANG 等[72]使用基于UHPLCQ-TOF-MS 的脂质组学技术对人乳、牛乳和骆驼乳中的脂质进行分析，共鉴定到13 个亚类的脂质，包括TG、DG、SM、PC、Cer、HexCer、Hex2Cer、PE、PG、PS、PI、PA、CL；LIU 等[73]使用基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 的脂质组学技术对不同泌乳期及产地的山羊乳进行对比分析，共鉴定到14个亚类共计756种脂质，包括CL、Cer、LPC、LPE、PC、PE、PG、PI、脂酰肉碱（acyl carnitine，AcCa）、HexCer、SM、FA、DG、TG。

此外，大气压化学电离质谱（atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry，APCI-MS）和新型的敞开式质谱（Ambient MS）也较多地应用于脂类分析，然而由于乳脂组成的复杂性与现有技术的局限性，任何一种单一的分析方法都无法检测所有的脂质种类。但是，不同分析方法的结合可以较为有效地克服单一技术存在的局限性。

3 乳脂质组学的生物信息学分析

3.1 脂质分类与脂质数据库

通过质谱获得的原始数据需要在统计分析之前先进行识别、标准化和归一化等操作，最终才可以获取用于脂质组学分析的具体数据。许多国家和机构均建立了自己的脂质组学数据库（表1）。

LMSD脂质数据库是美国于2003年发起的“脂质代谢和代谢途径研究”项目的成果。该脂质数据库根据脂质基本骨架的差异将脂质分为八类，分别为包括脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、甾醇脂、烯醇脂、糖脂和聚酮。LMSD 脂质数据库可鉴定超过168 万种脂质，并提供超过1 万种脂质的结构信息，其数据来源主要有：（1）LipidBank、LIPIDAT及其他脂质数据库；（2）参与LMSD项目的实验室及其合作者；（3）LMSD项目中通过试验表征的脂质；（4）从已知脂质中提取分离得到的脂质。LMSD 也是目前国际脂质组学研究中使用最广泛、脂质信息最全、分类最权威的脂质数据库。

3.2 脂质组学分析软件

近年来，随着脂质组学分析水平和检测技术的大幅进步，一大批基于质谱数据分析的脂质组学分析软件不断涌现，并具有数据导入、质谱过滤、峰检测、色谱比对、标准化、可视化、多元统计分析、代谢通路分析、数据输出等多种功能（表2）。脂质分子通常要经过脂质数据库检索或软件识别，并通常选择内标法进行脂质的定量分析。首先对采集到的质谱数据进行同位素定标，然后分析内标物和质谱中各测试脂质的信号强度。最后，根据两者的比值计算出相应的比例。不同种类的脂质在质谱中的响应灵敏度不同，采用内标法定量存在一定的偏差，但由于大多数研究反映了生物系统某一过程中脂类的变化，因此这种定量方法基本可以满足大部分脂质组学的研究要求。

以模式识别（pattern recognition，PR）为基础的多元统计分析（multivariate statistical analysis，MSA）是目前脂质组学生物信息学（bioinformatics）分析中常用到的方法[87]。PR 是数据中模式和规则的自动识别，可用于统计数据分析、信号处理、图像分析、信息检索、生物信息学、数据压缩、计算机图形学和机器学习等领域[88]。目前，应用于脂质组学数据分析的PR主要包括无监督模式识别（unsupervised pattern recognition，UPR）和有监督模式识别（supervised pattern recognition，SPR）[81]。UPR 指为事先未假定训练数据的标记与分组，利用降维处理的方式在数据中查找数据内部的固有模式，然后用于确定其数据的分组情况、筛选生物标志物、或用于确定新数据

的正确输出范围等。常见的UPR 分析有主成分分析（principal component analysis，PCA）、层次聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）等。SPR 与UPR 相反，指事先假定练数据的标记与分组，利用降维处理的方式在数据中查找数据内部的固有模式，用以分组检验或生物标志物的筛选[89]。常见的SPR 分析有偏最小二乘法判别分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（orthogon partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）等。在OPLS-DA 使用的同时也经常伴随使用置换检验（permutation validation），用以检验所使用的模型是否存在过拟合的现象[90]。总而言之，MSA 可用于鉴定脂质代谢物与生理表型之间的关联，并可有效地挖掘大量数据中的脂质生物标志物。同时，MSA 还包括应用生物信息学技术来构建脂质代谢网络，特别是与特定蛋白质和基因相关的脂质代谢网络。然而由于脂质成分及结构的复杂性，目前关于脂质组学中代谢通路的分析软件及方法仍有待开发。

表1 脂质组学数据库Table 1 Database of lipidomics

表2 脂质组学分析软件Table 2 Analysis software of lipidomics

4 结论

随着脂质组学分析水平和检测技术的发展，有关乳脂质组学的研究与应用取得了大量令人瞩目的成果，包括在脂质分子水平上鉴定和定量了数百种人类和其他哺乳动物的乳脂，为婴幼儿配方乳粉的研发提供了详实的理论依据与丰富的数据支持。然而，目前脂质组学仍存在一些技术难题亟待解决。首先由于脂质结构的复杂以及数量众多，因此较难所有的脂质进行分离并检测；其次，不同的脂质的含量差异巨大，因此对脂质分子的精确定量较为困难；同时，由于脂质标准品较难获得，因此也进一步限制了脂质组学的定性与定量分析。另外，脂肪酸酰化位置异构、双键位置异构、双键立体异构也是目前脂质组学研究中的热点与难题。与此同时，将脂质组学的数据信息与转录组学、蛋白质组学、代谢组学等多组学数据进行联合分析，以及不同的脂质在分子水平上的生物学功能差异也将成为脂质研究的重点。