LED补光对弱光下番茄幼苗叶绿素荧光特性的影响

纪建伟，李金鹏，董贞芬，李征明，刘珍珍，高湘荃，缪新颖

（1.沈阳农业大学信息与电气工程学院，沈阳110161；2.大连海洋大学信息工程学院，辽宁大连116023）

叶绿素荧光参数的变化与光合作用的各过程密切相关，光照强度是影响高等植物叶片的结构与功能极为重要的环境因子[1],太阳辐射是植物生长发育的主要来源，植物器官分化、建造、产量形成与品质优劣都是以光合速率和净光合累计值为基础的。光是植物生长发育的重要因子之一,北方地区冬季的蔬菜一般都是温室大棚里种植的，但由于设施环境对光照的限制,温室内往往产生弱光逆境,因此园艺植物弱光胁迫已成为育种领域研究的热点。“弱光”一词在生理学方面的定义尚不明确，通常认为环境光强持久或短暂显著低于光饱和点，但不低于限制其生存的最低光照强度时的光环境，可以称为弱光逆境[2]。叶绿素荧光技术以其不需破碎细胞、简便快捷等优势，在农业中广泛应用，国内外多以叶绿素荧光参数为指标，检测植物受胁迫状态[3]。目前，国内外研究者在作物方面的荧光研究主要集中在叶绿素荧光参数技术[1]、快速荧光动力学技术[4]、叶绿素荧光光谱技术[5]，但由于植物内部因子分布不均匀，在经过同一种胁迫条件受到的伤害也可能是不均匀的，从而在同一时间同一片叶上也会展现出不同的荧光活性[6]。而叶绿素荧光可以直接反映植物光系统的生理情况，植物叶绿素荧光成像技术作为最早实用化的叶绿素荧光成像技术，是目前世界上最权威、使用范围最广、种类最全面、发表论文最多的叶绿素荧光成像技术。本研究以番茄作为研究对象，通过使用叶绿素荧光仪分别对番茄幼苗进行弱光胁迫与补光恢复的测量，获取番茄幼苗的叶绿素荧光参数以及荧光图像，通过荧光图像提取特征值，与叶绿素参数进行合并生成数据表，使用BP 神经网络对植物受到胁迫状态以及补光恢复进行识别，为研究植物生长受环境胁迫后的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验在沈阳农业大学设施农业生物信息检测实验室进行，选取辽园多丽、园艺L-404以及草莓番茄3个品种作为研究对象，昼夜温度为(25±2)℃/(15±2)℃，相对湿度为50%～75%,光照以日均光合有效辐射600μmol·m-2·s-1进行培育，育苗周期为35d[8]。出苗后筛选长势相同、叶片完整的番茄幼苗作为试验对象。

1.2 试验设计

试验采用自然光照（约18000lx）将番茄苗在统一环境下培养，通过人工环境控制模拟阴天天气过程，人工箱设置参数为：白天时间10h，人工箱光照强度设置参数33%（约6000lx），温度25℃；夜间时间10h，光照强度0，温度15℃，恒定湿度65%的人工模拟弱光环境，并且在人工箱环境的第1 天、第3 天、第5 天、第7 天、第9 天、第11天、第13天进行叶绿素荧光参数测量。第13天测量结束后，人工箱设置参数改为：白天时间10h[8]，人工箱光照强度设置参数100%（约23000lx），温度25℃；夜间时间10h，光照强度0，温度15℃，恒定湿度65%的环境进行补光，并于第15天、第17天、第19天、第21天、第23天、第25天测量叶绿素荧光参数。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 叶绿素荧光参数的测定 进行测量前首先要进行暗适应30min,图1为普通相机所获取的图像与选用德国WALZ 公司IMAGING-PAM 蓝光版叶绿素荧光成像系统获取的叶绿素荧光图像，该系统可以在不破坏叶片的情况下快速获取叶绿素荧光图像以及检测叶绿素参数。通过使用IMAGING-PAM 叶绿素荧光成像系统配套的软件IMAGINGWIN，在叶茎、叶片、叶脉上分别选取多个测量点，软件的选择图片类型（Select type of image）区域，共有18 个荧光参数可供选择，决定了图像窗口显示的图像类型。选取基础荧光Fo、荧光F、暗适应后的最大荧光Fm、光下最大荧光Fm’、PSII最大光合效率Fv/Fm、PSII实际光合效率Y(II)、调节性能量耗散的量子产额Y(NPQ)、非调节性能量耗散的量子产额Y(NO)、非光化学淬灭NPQ/4、非光化学淬灭系数qN、光化学淬灭系数qP、光化学淬灭系数qL这12个荧光参数图像进行讨论分析，从荧光图像中可以明显看出经弱光后叶片受胁迫情况,受胁迫区域在荧光图像上显示为高亮区域。

图1 受胁迫后番茄叶片的荧光图像Figure 1 The fluorescence image of tomato leaves under stress

1.3.2 叶绿素荧光图像的获取 荧光成像技术从植物的荧光图像中提取荧光参数、纹理、荧光强度等信息，处理并分析提取出来的颜色信息来应用于实际胁迫检测。选取F、Fm’、Fo’、Y(II)、Y(NPQ)、Y(NO)、NPQ、qN、qP、qL参数作为评估弱光胁迫后番茄叶片损伤的备选参数，各参数均由系统自动生成。

1.3.3 数据统计与分析 采用Excel 2016对获取的荧光参数进行统计，求出测量点各荧光参数的均值，绘制折线图，分析各荧光参数在受胁迫后的变化。

2 结果与分析

2.1 弱光胁迫及补光恢复对番茄幼苗的影响

2.1.1 叶绿素荧光参数的影响 首先对测得的荧光参数进行初步的处理，各测量点测量的参数取均值，整理后绘制各个参数曲线图2。由图2可知，荧光参数F、Fm’、Fo’、Y(NO)、qN受胁迫和补光后无明显变化。发生胁迫后，Y(II)、qP、qL随胁迫时间增长呈下降趋势，胁迫发生的第13 天，通过实际测量发现，3 个品种的番茄（L-404、草莓番茄、辽园多丽）测量的PSII 实际光合效率Y(II)分别比初始值降低36.6%、39.1%、34.1%，补光后第25d分别恢复至初始值的91.3%、86.3%、85.7；光化学淬灭系数qP分别比初始值降低35.1%、28.2%、31.3%，补光后分别恢复至初始值的89.9%、94.2%、92.7%；光化学淬灭系数qL分别比初始值降低48.5%、43.6、47.5%，补光后恢复至初始值的84.0%、88.6%、84.4%。Y(NPQ)、NPQ呈上升趋势，其中调节性能量耗散的量子产额Y(NPQ)分别比初始值升高21.6%、28.7%、25.1%，补光后分别恢复至初始值的103.4%、100.7%、102.4%；非光化学淬灭系数NPQ分别比初始值升高22.2%、23.0%、23.9%，补光后分别恢复至初始值的103.3%、102.8%、104.7%。其中这与DONG 等[9]利用叶绿素荧光成像技术分析冷害对番茄幼苗影响的结果一致。毛剑飞等[10]在弱光胁迫及强光恢复对设施红地球葡萄叶片光合及衰老特性的影响研究中，也得出光化学淬灭系数qP较弱光处理阶段有降低趋势，非光化学淬灭系数NPQ有上升趋势这一结论。同时对于不同品种的番茄，受胁迫程度以及补光的恢复也有所差异。

图2 番茄幼苗受胁迫及补光恢复后各荧光参数变化曲线Figure 2 Changes of fluorescence parameters of tomato seedlings under stress and light supplement

2.1.2 叶绿素荧光参数图像 叶绿素荧光图像分析相比于传统方法[11]，有着更直观、准确、快速的优点，荧光图像可以发现肉眼无法看到的损伤，选用德国WALZ 公司的最大叶绿素成像系统IMAGING-PAM-MAX/L 蓝光版进行叶片的叶绿素荧光成像，获得不同参数下的荧光图像如图3，对比各个参数的图像后可以明显的看出，F、Y(NO)、Fo’、Fm’、qN上无明显冷害区域，Y(NPQ)、Y(II)、NPQ、qP、qL上有的冷害区域较为明显。王文森[12]在对大豆在受到严重胁迫下的研究,将Y(NO)、Y(II)、qN、qP、qL叶绿素荧光参数及图像的变化作为依据，得出可以对qP和qN进行检测进而识别受到的主要胁迫为干旱/NaCl 胁迫。因此，可将Y(NPQ)、Y(II)、NPQ、qP、qL参数及图像用于评估番茄幼苗弱光胁迫及补光恢复的有用参数。

图3 不同叶绿素荧光参数下的荧光图像Figure 3 Fluorescence image under different chlorophyll fluorescence parameters

2.2 筛选番茄叶片光敏感性的有用参数

调节性能量耗散的量子产额Y(NPQ)较大，一方面表明光是过剩的，另一方面表明植物有能力通过自身的调节机制耗散掉过剩的光能而自我保护，如果植物没有这种自身的耗散机制，过剩的光能会诱导产生单线态氧或者自由基，这对植物的非常有害的[12]。参数NPQ为非光化学荧光淬灭，是过剩光能的指示剂，反映PSII 耗散过剩光能进行自我保护的下调作用，植物主要通过跨膜质子梯度介导的叶黄素循环来耗散多余光能。光化学淬灭系数qP与光化学淬灭系数qL均反映的是PSII 反应中心的开放程度，值在0～1 之间。PSII 实际光合效率Y(II)这个荧光参数得自于荧光强度的比值，任何荧光激发强度或者叶绿素浓度的不均一因素都会被排除，而剩下的不同则表示光合活性的不同了，且Y(II)在一定程度上反应植物光和系统的综合状态。综合参数曲线及荧光图像之间的对比，推荐Y(II)作为筛选番茄幼苗弱光胁迫的有用参数，通过对Y(II)荧光图像的进一步分析，来识别番茄叶片受胁迫的损伤。

2.3 提取颜色特征表格

特征提取是指使用计算机提取图像信息，决定每个图像的点是否属于一个图像特征。颜色特征是一种全局特征，描述了图像的表面性质。选择Y(II)作为评估胁迫有用参数，将番茄幼苗受胁迫以及恢复过程中的Y(II)荧光图像作为图像信息的提取对象（图4），从荧光图像上可以看出受胁迫区域发生的变化及补光后恢复的情况。

图4 弱光胁迫到补光恢复的Y(II)荧光图像Figure 4 Y(II) fluorescence image from low light stress to light compensation recovery

由于大部分的数字图像都是用RGB 这种颜色空间表达的，然而，RGB 空间结构并不符合人们对颜色相似性的主观判断也不准确。Lab 颜色空间色域大，定义的色彩多，且处理的速度与RGB 模式同样快。因此，主要提取的颜色特征为R（红色）、G（绿色）、B（蓝色）、L（亮度）、a（红色到绿色的范围）b（黄色到蓝色的范围），6 组特征值如图5。

图5 颜色特征值表格Figure 5 Color eigenvalue table

2.4 统计分析模型训练

人工神经网是一种无需事先给定确定关系，通过自身的训练，学习某种规则来进行预测的数学建模方法[13]，适用于电气控制、模式识别、预测估计等，也在生物学、植物学、经济学、医学等领域解决了许多实际问题，表现出了良好的智能特性。BP 神经网络（back propagation）是一类基于误差逆向传播的方法，具有很强的非线性映射能力和柔性的网络结构，可以说是迄今为止最成功、应用最广泛的神经网络学习算法[14]。本研究以3个品种的番茄幼苗在弱光胁迫及补光恢复过程中的Y(II)荧光图像为样本，设计一种对补光恢复程度识别的模型，通过提取荧光图像R、G、B、L、a、b共6个颜色特征值，得到模型所需的288个样本，其中144个用于训练，训练次数为1000，使用trainglm 函数(Levenberg-Marquardt 算法，是一种迭代求函数极值的算法,有着收敛速度快，稳定性强的特点)，经过建模和训练后，对受到弱光胁迫后并恢复的样本识别率达到87.671%，总体准确率R=98.9%，均方误差为u=0.11421，具有一定准确性，结果如图6。

图6 基于Y(II)的弱光胁迫后补光恢复识别模型均方误差和训练结果Figure 6 The mean square error and training results of the recognition model based on Y(II)after light stress and light recovery

3 讨论与结论

弱光环境对植物的生长必然有一定的影响，由于设施环境的限制，往往满足不了植物生长的最适光照条件。目前对于补光的研究，也仅仅局限于人工追加光源进行补光，并不能达到智能、准确的按需补光。针对农作物环境胁迫检测的传统有损检测方法，存在着检测周期长、过程繁琐且对植物损伤大等问题，提出了叶绿素荧光成像技术对番茄幼苗受弱光迫及补光恢复程度的快速无损检测的方法[15]。叶绿素荧光动力学参数[16]可以快速、无损伤的反映环境胁迫对植物的影响[17]，现已广泛的应用于光合生理和逆境生理等研究领域。

本研究以常见的番茄幼苗作为研究对象，经过试验筛选出Y(II)作为评估弱光胁迫参数，并通过Y(II)的荧光图像提取特征值，利用BP 神经网络，借助MATLAB建立了基于Y(II)单参数的番茄幼苗弱光胁迫状态识别模型[18]，对样本的识别率达到87.671%，结果表明采用BP神经网络对植物补光后的识别具有一定的准确性。建模结果显示，以Y(II)单参数建立的模型识别率最高，达到97.9%，识别效果良好。

在未来的研究中，可以通过增加不同补光时间、不同光照强度、不同光质配比，以及选取更加典型的颜色特征，建立完善的弱光胁迫识别系统[19]，为实现番茄幼苗弱光胁迫的自动识别、智能补光提供参考价值[20]。因此，在今后研究中，将利用多种建模方法来搭建一个对番茄幼苗弱光胁迫状态识别率更高的模型。