基于TLR4/MyD88/NF-kB信号通路探讨木犀草素对MPTP诱导的帕金森病模型小鼠的炎症影响

李 旭，王 玥，刘国力

(1.中国医科大学附属第一医院药学部,沈阳110000；2.辽宁中医药大学解剖组胚教研室,沈阳110847)

木犀草素（luteolin,Lu）是存在于多种药用植物中的黄酮类化合物,具有多种药理活性,包括抗氧化、抗炎和神经保护等作用。有研究表明,木犀草素可通过抑制核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)入核而下调巨噬细胞中炎症细胞因子的表达,同时,它还可抑制一氧化氮和促炎性类花生酸的生成[1],说明其具有有效的抗炎作用。木犀草素联合芦丁组合物可以通过调节脑内递质水平、减少神经元损伤和抑制炎症反应从而改善MPTP 所导致的小鼠运动协调能力损伤[2]。因此,本研究通过腹腔注射MPTP 构建帕金森病（parkinson disease,PD）小鼠模型,并使用木犀草素处理,旨在研究木犀草素对帕金森病小鼠模型的影响,并探究其是否可通过TLR4/yD88/NF-kB信号通路抑制小鼠脑内黑质区免疫炎症反应而改善小鼠的运动能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 木犀草素（成都瑞芬思生物科技有限公司）；β-actin,TH,Bcl2,BAX,TLR4,MyD88,p-p65/NF-kB,NF-kB 和HRP-labeled goat anti-rabbit/mouse IgG 抗体均来自于Cell Signaling Technology；免疫组化试剂盒（福州迈鑫生物技术有限公司）,牛血清白蛋白（Sigma）,小鼠的TNF-α,IL-6 和IL-1β 的ELISA 试剂盒均购自于Raybiotech；PVDF膜,蛋白Marker（Thermo）。

1.1.2 仪器 全自动旷场记录仪（江苏淮北正华）、旋转棒仪器（IITC Life Science）、低温离心机、酶标仪、BIORAD凝胶图像分析系统、电泳仪、水平摇床、组化显微镜、冰冻切片机。

1.1.3 试验动物与分组 10～12 周龄C57BL/6 野生型小鼠45 只,均购于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK（京）2020-0004],体重20～25g。试验动物分笼饲养,每笼3～4 只,自由饮食,12h 昼夜交替饲养,饲养室温度保持在22～25°C。根据SPSS统计软件产生随机数字分为:对照组、模型组、治疗组,每组15只；同月龄同背景15只,设为正常对照组,具体分组及给药方法为：对照组，腹腔注射生理盐水14d;MPTP模型组，首先给予生理盐水3d,然后第4 天腹腔注射30mg·kg-1·d-1MPTP（溶于生理盐水）,共5d,最后腹腔注射生理盐水14d；木犀草素治疗组，首先给予3d木犀草素（溶于生理盐水）,然后第4天腹腔注射30mg·kg-1·d-1MPTP,共5d,继续腹腔注射木犀草素6d。

1.2 方法

1.2.1 旷场试验 采用林臻等[3]方法,首先使3组小鼠在开始正式试验前适应环境。将小鼠放在旷场中心,整个试验的持续时间为5min。主要记录小鼠在旷场中心停止的时间和行走的总距离。使用的软件为SMART v3.0软件（Harvard Apparatus）。

1.2.2 旋转杆试验 本试验使用旋转棒仪器进行行为能力的测试。每个转轴以4r·min-1的速度开始旋转,并且独立计时,使旋转速度在5min 内匀速增加至40r·min-1。记录小鼠从转棒上掉落时的时间和距离。每只老鼠测试3次。

1.2.3 小鼠脑组织取材 腹腔注射戊巴比妥钠（40mg·kg-1）麻醉小鼠。麻醉后眼球取血,室温静置20min 后离心取上清,-80°C 保存备用,然后小鼠经生理盐水灌流后迅速取出大脑放在冰上,从中间矢状缝切开,一半放入4%多聚甲醛中固定,常规制备冰冻切片,用于免疫组化染色；另一半放入EP 管内,-80°C 保存备用,用于Western blot等分子生物学指标检测。

1.2.4 Western blot检测 各组小鼠海马皮层组织分别称重,小剪刀剪碎样品（冰上操作）,按1∶5比例加入蛋白裂解液,超声粉碎,4°C 裂解过夜,4°C 12000r·min-1低温离心 30min,取上清,BCA 蛋白浓度测定,每管 8μg 蛋白分装,-80°C 冻存待用。12% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品,5%脱脂奶粉封闭20min,Bace1 和PS1 抗体（1∶3000）4°C 孵育过夜,二抗室温孵育 1h,ECL 发光（ECL 试剂盒,Pierce）。洗膜重新封闭后,β-actin 抗体（1∶12000）孵育,二抗孵育,发光,胶片曝光显影。以β-actin作为上样量参照标准。

1.2.5 ELISA 检测 取小鼠黑质,使用胰蛋白酶使其匀浆,严格按照酶联免疫吸附法试剂盒操作,测定小鼠黑质区中TNF-α,IL-6和IL-1β的含量。

1.2.6 免疫组化染色 切片正常羊血清室温预孵育1h,TH 抗体（1:100）孵育,4°C过夜。切片经0.01M 的磷酸盐缓冲液（pH值7.4）)充分漂洗后,用二抗（生物素标记的羊抗兔或鼠的IgG）室育孵育2h,经0.01M的磷酸盐缓冲液（pH 值7.4）)充分漂洗后,加入三抗（外源性过氧化物酶阻断）,37°C 孵育30min,室温暗处DAB 显色3～5min,中性树胶封片。

1.2.7 统计分析 数据用均数±标准误（SEM）表示,每组试验平行重复3次。采用单因素方差分析（ANOVA）比较均值之间的差异。数据分析采用Prism v7.0 软件，p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 木犀草素改善由MPTP诱导的PD模型小鼠的运动能力和焦虑行为

旷场试验主要用于评估小鼠自发运动功能和探索行为。由表1可知,与对照组相比,MPTP模型鼠行走的总距离和进去中心区域的总距离明显缩短,进入中心区域的次数明显减少,而与MPTP 模型组相比,木犀草素处理组小鼠行走的总距离和进去中心区域的总距离显著延长。除此之外,小鼠进入中心区域的总次数明显增加,差异具有统计学意义（p＜0.05）。

表1 各组小鼠旷场试验测试结果Table 1 Results of the open field test every group mice

由表2 可知,与对照组相比,MPTP 模型组小鼠旋转时间和行走距离明显缩短,而与MPTP 模型组相比,木犀草素处理后,小鼠旋转时间和距离明显延长（p＜0.05）。以上结果说明，木犀草素能够改善MPTP 诱导的PD 模型鼠的运动能力。

2.2 木犀草素对MPTP诱导的PD模型小鼠黑质酪氨酸羟化酶（TH）的影响

由图1可知,与对照组相比,MPTP模型组的TH 染色阳性神经元数目显著减少,与模型组相比,木犀草素处理后神经元数目明显增多,Western blot结果也证实木犀草素处理后可明显提高由MPTP 诱导的黑质区TH 低表达（图2）（p＜0.05）。以上结果说明木犀草素具有神经保护作用,抑制多巴胺能神经元死亡。

表2 各组小鼠旋转杆试验测试结果Table 2 Results of the rotarod test every group mice

图1 各组小鼠黑质区和纹状体区的TH染色结果比较Figure 1 Comparison of the expression of TH in the SN and striatum in each group

图2 各组小鼠黑质区中TH的蛋白表达量变化Figure 2 Changes of protein expressions of TH in SN of mice with in each group

图3 各组小鼠黑质区中Bcl2和BAX的蛋白表达量变化Figure 3 Changes of protein expressions of Bcl2 and BAX in SN of mice with in each group

2.3 各组小鼠黑质区凋亡蛋白表达情况

由图3 可知,与对照组相比,模型组小鼠Bcl-2 的蛋白表达明显降低,BAX 蛋白表达水平显著升高,Bcl-2/BAX 比值降低；相比模型组,使用木犀草素处理小鼠后,Bcl-2蛋白表达显著升高,BAX 蛋白表达水平显著降低,Bcl-2/BAX 比值升高（p＜0.05）,说明木犀草素能够抑制由MPTP 诱导的PD 模型鼠的黑质区神经元凋亡。

2.4 木犀草素对MPTP诱导的PD模型小鼠黑质区炎症因子水平的影响

由表3可知,模型组小鼠黑质区炎症因子TNF-α,IL-6 和 IL-1β 水平高于对照组,木犀草素给药处理后,治疗组小鼠黑质区炎症TNF-α,IL-6 和IL-1β因子水平显著降低（p＜0.05）。以上结果说明，木犀草素可抑制MPTP 诱导帕金森模型小鼠脑内免疫炎症反应。

表3 各组小鼠ELISA检测结果Table 3 Results of the ELISA every group mice

2.5 木犀草素对MPTP诱导的PD模型小鼠黑质区中TLR4/MyD88/NF-kB信号通路的调节作用

与对照组相比,模型组中TLR4,MyD88 和p-p65 NF-kB 的表达量显著性升高；当给予木犀草素后,其TLR4,MyD88 和p-p65 NF-kB 表达量显著性降低（图4）（p＜0.05）。以上结果说明,木犀草素可能通过TLR4/MyD88/NF-kB信号通路抑制小鼠黑质区免疫炎症反应,进而改善MPTP诱导的PD模型小鼠的运动能力。

图4 各组小鼠黑质区中MyD88和NF-κB/TLR4的蛋白表达量变化Figure 4 Changes of protein expressions of MyD88 and NF-κB/TLR4 in SN of mice with in each group

3 讨论与结论

目前研究认为,帕金森病是一种累及多系统的神经退行性疾病,伴有认知功能障碍、焦虑抑郁情绪等多种非运动症状,由于无有效的治愈手段,因此对生活质量的影响较大[4]。其主要病理特征是黑质多巴胺能神经元缺失与死亡。近年来研究结果显示,神经炎症与PD 的发生发展密切相关[5-7]。在PD 动物模型中也发现,黑质区除了一氧化氮合酶升高外,伴随着小胶质细胞和星形胶质细胞活化[8]。因此,炎症可能是PD 发病过程中重要的致病因素。研究显示,黄酮类化合物碧桂花醇是一种常见的膳食补充剂,其可通过抑制由小胶质细胞和星形胶质细胞所引起的免疫炎症反应,进而改善PD小鼠的运动能力,因此早期应用黄酮类药物可能是预防和治疗帕金森病的潜在策略[9]。而木犀草素也是一种黄酮类化合物,具有多种药理学作用,包括抗氧化,抗炎和保护神经元等作用。研究发现,木犀草素能够以剂量依赖的方式抑制巨噬细胞中TNF-α和IL-6的产生。除此之外,木犀草素可降低由鱼藤酮引起的小鼠多巴胺能神经元MN9D 细胞氧化应激水平,进而起到保护神经元的作用[10],而本研究证实木犀草素通过抑制免疫炎症反应而减少多巴胺能神经元凋亡,最终改善由MPTP 诱导的PD 模型鼠的运动能力。

TLR4是Toll样受体家族（toll-like receptors,TLRs）受体家族重要成员,是神经元、小胶质细胞和星型胶质细胞膜上的重要炎性受体,其功能主要是促进炎性细胞因子和免疫调控分子表达[11-12]。MyD88 是TLR4 介导炎性信号通路的重要胞内接头蛋白,具有负责募集下游信号分子的N 端死亡结构域（death domain,DD）和承接TLRs活化信号的C 端TIR 结构域,NF-κB 是TLR4/MyD88 下游的重要节点,由胞浆转移到胞核内,发挥转录调控作用,激活炎症因子IL-1β、IL-8和TNF-α 等炎性基因的表达,最终导致炎症因子释放[13-16]。本研究结果表明,与对照组相比,MPTP 造模后炎症因子TNF-α,IL-6 和IL-1β 表达增加,而当木犀草素处理后,可显著降低TLR4,MyD88和NF-κB 的蛋白表达,说明TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路介导了木犀草素对炎症因子TNF-α,IL-6和IL-1β 的调控作用。

本研究中,PD小鼠黑质部位的发生炎症反应的同时,伴随大量的多巴胺能神经元凋亡,与对照组相比,MPTP诱导后,TH染色阳性细胞数减少,凋亡通路被激活,凋亡相关蛋白Bcl-2/BAX比值降低,而木犀草素处理后,TH染色阳性细胞数明显增多,Bcl-2/BAX比值升高,说明木犀草素可抑制MPTP诱导的小鼠黑质区多巴胺能神经元凋亡,进而保护神经元,缓解小鼠的帕金森样改变。除此之外,行为学试验进一步证实木犀草素可改善MPTP 诱导小鼠的运动能力。

本研究结果表明，TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路介导了木犀草素对MPTP 诱导的帕金森小鼠脑内免疫炎症反应的抑制作用,进而缓解小鼠黑质区多巴胺能神经元变性及凋亡,最终改善小鼠的运动能力。