豇豆多糖的超声辅助提取条件优化及体外抗氧化研究

杨 强，王 柱，盖智涵，亓 鑫，王思宇，李拖平，李苏红

（沈阳农业大学食品学院，沈阳110161）

豇豆属豆科类植物，在北方主要作为蔬菜食用，而在西北地区豇豆粉（又称豆面）常做为主食。豇豆营养丰富，含有蛋白质、碳水化合物、维生素、纤维素和矿物质等，具有抗氧化、延缓衰老、促进肠道蠕动和调节血糖等作用[1-3]。近些年，植物多糖由于其天然无害、来源范围广且大多具有生理功能活性等特点成为研究热点，而豇豆多糖作为豇豆中主要活性成分之一，具有明显的降血糖、降血脂等功效，在保健食品和医药领域有着广阔的开发前景[4-5]。多糖提取方法常见的主要有热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶解法等[6-7]。热水提取由于其安全操作和对环境的保护而常被视为是提取多糖的常用方法之一[8-9]。然而，其缺点是提取时间长以及多糖的产率低。因此，为提高豇豆多糖的得率，本研究拟采用超声辅助法提取豇豆多糖，在单因素的基础上，采用响应曲面法优化豇豆多糖的提取工艺条件，并对提取的多糖进行抗氧化活性评价，以期为豇豆深加工提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豇豆粉购于山西兴县山花烂漫农业综合开发有限公司；浓硫酸、苯酚、硫酸亚铁、水杨酸、邻苯三酚、95%乙醇、无水乙醇、铁氰化钾、三氯乙酸、购于国药集团化学试剂有限公司,为分析纯；2’-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)购于德国默克公司。

1.2 仪器与设备

ZB604C 型分析天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）；JHH6A 型数显恒温水浴锅（常州智博瑞仪器制造有限公司）；R1002B 型旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；CR21N 型高速冷冻离心机（日本HITACHI）；FDI-B50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；VCX-750型超声波细胞破碎仪（美国Sanics）；SHZ-D型真空泵（浙江台州求精真空泵有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 豇豆粗多糖提取工艺 豇豆粉→超声辅助提取→离心收集上清→旋转蒸发→乙醇沉淀→冷冻干燥→粗多糖。

式中：m为粗多糖质量(g)；m1为豇豆粉质量(g)。

1.3.2 不同超声辅助提取条件对豇豆多糖得率的影响 （1）不同超声功率对豇豆多糖提取率的影响。固定料液比1∶30g·mL-1、提取时间2h、提取温度90℃、超声时间2min、在超声额定功率的20%、30%、40%、50%、60%（额定功率750W）下进行单因素试验。（2）不同超声时间对豇豆多糖得率的影响。固定料液比1∶30g·mL-1、提取时间2h、提取温度90℃、超声功率30%、在超声时间2，3，4，5，6min下进行单因素试验。

1.3.3 豇豆多糖提取的单因素试验 （1）提取温度对豇豆多糖得率的影响。超声功率50%、超声时间5min、固定料液比1∶30g·mL-1、提取时间2h、在提取温度为60，70，80，90，100℃下进行单因素试验，试验重复3次。（2）提取时间对豇豆多糖得率的影响。超声功率50%、超声时间5min、固定料液比1∶30g·mL-1、提取温度90℃，在提取时间1，1.5，2，2.5，3h 下进行单因素试验，试验重复3 次。（3）料液比对豇豆多糖得率的影响。超声功率50%、超声时间5min、固定提取时间2h、提取温度90℃，在料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50g·mL-1下进行单因素试验，试验重复3次。

1.3.4 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，利用响应面分析法对提取工艺条件进行进一步的优化。以提取时间（A）、提取温度（B）和液料比（C）为考察的变量，以豇豆多糖的得率为响应值（Y），设计三因素三水平的响应面试验分析，优化超声辅助提取豇豆多糖的最佳工艺参数，试验因素与水平设计见表1。

1.3.5 豇豆多糖体外抗氧化活性

1.3.5.1 豇豆多糖（CPP）对羟基自由基清除能力测定。1mL 多 糖 溶 液 +1mL FeSO4（9mmol· L-1）+1mL 水 杨 酸（9mmol·L-1）+1mL H2O2（8.8mmol·L-1），37℃水浴 30min，测OD510，以VC水溶液做参照，根据式（2）计算清除率。

式中：Ac为超纯水代替样品时的吸光度；Ai为加入样品溶液后测得的吸光度；Aj为不同浓度样品的本底吸光度。

1.3.5.2 豇豆多糖（CPP）对DPPH 自由基清除作用的测定。2.0mL 多糖溶液+2.0mL DPPH 溶液（无水乙醇配置），摇匀，30℃静置30min，测OD517，以VC水溶液做参照，根据式（3）计算清除率。

表1 响应面分析因素和水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

式中：Ac为超纯水代替样品时的吸光度；Ai为加入样品溶液后测得的吸光度；Aj为不同浓度样品的本底吸光度。

1.3.5.3 ABTS自由基清除能力的测定。0.2mL ABTS储备液（7.4mmol·L-1）+0.2mL K2S208（2.6mmol·L-1），混合避光12h 得到ABTS 阳离子溶液；用磷酸盐缓冲液（pH值7.4）稀释ABTS阳离子溶液40～50倍，使其OD734为0.70±0.02，待用；100μL 不同浓度的多糖溶液+3.9mL ABTS 阳离子溶液，以VC水溶液做参照，25℃下避光10min，测OD734，根据式（4）计算清除率。

式中：Ac为超纯水代替样品时的吸光度；Ai为加入样品溶液后测得的吸光度；Aj为不同浓度样品的本底吸光度。

1.3.5.4 总还原力的测定。1mL 样品+1mL PBS 缓冲液（0.2mol·L-1、pH 值 6.6）+1mL 铁氰化钾溶液（1g·100mL-1），震荡均匀，50℃恒温水浴 20min，+1mL 三氯乙酸（10g·100mL-1），4800r·min-1离心 5min，2mL 上清液+2mL蒸馏水+400μL三氯化铁（0.1g·100mL-1），测OD700AX。用PBS代替待测样品为A0，还原力表示为（A0-AX）/A0。

1.3.7 数据分析 采用Origin 8.5 绘制单因素试验图表并制作误差线，SPSS 21.0 对单因素数据进行显著性分析；采用Design-Expert 8.0.6进行响应面试验设计和分析，在相应条件下进行3次重复试验。

2 结果与分析

2.1 不同超声辅助提取条件对豇豆多糖得率的影响

2.1.1 不同超声功率对豇豆多糖得率的影响 热水提取豇豆多糖的得率为1.35%，经超声处理后豇豆多糖的得率显著升高，说明超声作用有助于多糖的溶出。由图1 可知，随着额定功率增大到50%时，豇豆多糖得率出现峰值。其原因是随着超声功率的增加其对多糖结构的作用力增加。豇豆粉吸收能量，导致温度升高和内部压力升高，促进细胞结构破坏，并使多糖溶解在溶剂中[10]。但是当功率超过50%时，豇豆多糖的得率明显下降。这可能是因为功率过大提供的能量过多，分子之间运动剧烈破坏了一部分的多糖[11]。

图1 超声功率对豇豆多糖得率的影响Figure 1 Effect of ultrasonic power on the yield of cowpea polysaccharide

2.1.2 不同超声时间对豇豆多糖提取率的影响 由图2 可知，超声时间从2min 增加到5min 时，随着时间的延长，豇豆多糖的得率也增加。这可能是因为时间的增加，溶液中吸收的超声波的能力增加，从而导致热量聚集在一起，加快了多糖的传质速度，有利于超声空化作用的产生，使得多糖从溶剂中析出。当超声时间超过5min，多糖得率呈现下降的趋势，这可能是因为空化作用的时间增加导致多糖链被破坏，从而影响多糖的得率[12]。因此，在本试验中确定超声功率为额定功率的50%，超声时间5min。

2.2 豇豆多糖提取的单因素试验

2.2.1 提取温度对豇豆多糖得率的影响 由图3 可知，在一定的时间下，随着温度的升高，豇豆多糖的产量增加，并在90℃达到最高。这是因为温度的提高会增加分子间的运动，加速细胞内的物质传递[13]。随着温度的升高，多糖的产率升高，原因可能是温度的升高有利于多糖的溶解，进而增加了多糖的得率。然而，当温度太高时一些多糖会分解，因此，多糖的产率会降低。考虑到实际工业生产中的消耗以降低成本，选择最佳提取温度为90℃。

图2 超声时间对豇豆多糖的得率的影响Figure 2 Effect of ultrasonic time on the yield of cowpea polysaccharide

图3 提取温度对豇豆多糖得率的影响Figure 3 Effect of extraction temperature on yield of cowpea polysaccharide

2.2.2 提取时间对豇豆多糖得率的影响 由图4 可知，多糖的得率随提取时间的延长而升高。当提取时间达到2.0h时，多糖的产量达到峰值，但超过2.0h时，随着提取时间的延长，多糖的得率下降，这可能是由于提取时间的延长导致了多糖的降解[14]，也可能是因为提取时间过长，多糖在提取后在高温下部分被破坏或降解，从而导致多糖产量下降。温度过高时，冷冻干燥的粗多糖的颜色为深棕色，需要进行脱色处理。因此，提取时间选择2.0h最适宜。

图5 料液比对豇豆多糖得率的影响Figure 5 Effect of material liquid ratio on yield of cowpea polysaccharide

2.2.3 料液比对豇豆多糖得率的影响 由图5 可知，当料液比为1∶40 时，豇豆多糖的产量最高。这可能是由于原料与水的比例增加时，细胞内部和外部的渗透压也升高，从而加速多糖在溶液中的溶解速度，进而提高豇豆多糖的得率[15]。然后，随着料液比的继续增加，多糖的得率随料液比的增加而降低，这种结果的出现可能是因为水与物质的比例过大导致植物细胞内外溶剂之间的浓度差异很大，过大的料液比会降低分子之间的相互作用，从而导致多糖产量下降[16]。

2.3 豇豆多糖提取工艺条件优化

2.3.1 模型方程建立和显著性分析 响应面试验设计及结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6软件，建立提取时间、提取温度及液料比三因子数学回归模型为：

表2 响应面优化试验设计与结果Table 2 Response surface optimization test design and results

由表3 可知，一次项中，B（提取温度）对多糖的得率的线性效果不显著（p＞0.05），A（提取时间）对多糖的得率线性效果极显著（p＜0.01），C（料液比）对多糖得率的线性效果显著（p＜0.05）。二次项中，A2、B2、C2影响均极显著（p＜0.01），AB显著（p＜0.05），AC、BC影响不显著（p＞0.05）。此模型显著性检测p值为0.0007，极显著，失拟项p值为0.1848，不显著。根据F值可知，各因素对多糖得率的影响大小依次为A（提取时间）＞C（液料比）＞B（提取温度）。

2.3.2 交互作用影响结果 从等高线的形状可以判断两个因素之间的交互作用是否显著。如果轮廓的形状近似于椭圆，则这两个因素之间的相互作用是很明显的。如果轮廓类似于圆形，则两个因素之间的相互作用不明显。由图6 可知，AB，AC 和BC 的轮廓线几乎是圆形的，这表明相互作用并不显著，该结论与表3 的结果一致。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由图6a可知，当料液比固定时，提取温度和提取时间对多糖得率的影响不显著。从单因素的角度来看，提取时间对多糖得率的影响更大。当提取温度固定时，多糖含量随提取时间的延长先升高后降低。由图6b 可知，当提取温度固定时，提取时间与料液比之间的相互作用不显著，并且从单一因素来看，提取时间对多糖得率的影响更大。当料液比保持不变时，多糖的得率随提取时间的延长先增加后降低。当提取时间为90℃时，多糖的得率最高。当提取时间保持不变时，多糖含量随料液比的增加先增加后减少。料液比为1∶40 时，多糖得率最高。由图6c可知，当提取时间固定时，提取温度与料液比之间的相互作用并不显着，但从单因素角度来看，料液比对多糖得率的影响更大。当提取温度固定时，随着料液比的增加，多糖得率先升高后降低。当料液比为1∶40时，多糖的率达到最大。当固液比固定时，随着提取温度的升高，多糖得率先升高后略有下降。提取温度为90℃，多糖得率最高。

图6 各因素交互作用对粗多糖得率等高线图和响应面图Figure 6 Contour map and response surface of interaction of various factors on crude polysaccharide yield

2.3.3 最佳工艺参数验证试验 通过Design-Expert 8.0.6模型预测了每个因素水平的最佳值：提取时间1.98h，提取温度93.73℃，料液比42.44g·mL-1。多糖得率的理论值为7.70%。结合单因素试验和响应面分析，对试验条件进行如下调整：提取时间2.0h，提取温度93℃，料液比1∶42。在此条件下，多糖得率为7.65%。多糖命名为CPP。

2.4 豇豆多糖体外抗氧化活性

2.4.1 豇豆多糖（CPP）对羟基自由基清除能力测定 羟基自由基被认为是活性最强的自由基，也是毒性最大的自由基，辐射损伤等物理、化学因子都会促进其形成，是造成生物有机体过氧化损伤的主要因素。由图7 可知，在0～5mg·mL-1范围内，随着浓度的增大，豇豆多糖对·OH 的清除率也随之增大。在其浓度为5mg·mL-1时清除率达到最高，为57%，而多糖的IC50为4.85mg·mL-1。

2.4.2 豇豆多糖（CPP）对DPPH 自由基清除作用的测定 由图8 可知，在0～5mg·mL-1范围内，豇豆多糖具有清除DPPH 自由基的作用，且清除能力呈量效正相关。当其浓度为5mg·mL-1时清除率可达75%。当浓度为2.51mg·mL-1时达到羟基自由基清除能力的IC50。

图7 豇豆多糖对羟基自由基的清除能力Figure 7 Effect of cowpea polysaccharide on the clearing ability of hydroxyl radicals

图8 豇豆多糖对DPPH自由基的清除能力Figure 8 Effect of cowpea polysaccharide on the scaveng‐ing ability of DPPH flee radicals

图9 豇豆多糖对ABTS自由基的清除能力Figure 9 Effect of cowpea polysaccharide on the scaveng‐ing ability of ABTS free radicals

图10 豇豆多糖的还原力Figure 10 Reducing power of cowpea polysacch-aride

2.4.3 ABTS 自由基清除能力的测定 由图9可知，在0～5mg·mL-1范围内，豇豆多糖对ABTS自由基清除力先升高后降低，当豇豆多糖的浓度达到3mg·mL-1时，ABTS 自由基清除能力最高为78%。当浓度为1.35mg·mL-1时达到ABTS自由基清除能力的IC50。以上说明豇豆多糖对ABTS自由基具有一定的清除能力。

2.4.4 还原力的测定 由图10可知，在0～3mg·mL-1范围内，豇豆多糖的总还原力明显增强；在3～5mg·mL-1范围内总还原力比较稳定。当豇豆多糖的浓度达到3mg·mL-1时，还原能力达最高为99.4%。当浓度为1.61mg·mL-1时达到还原力的IC50。

3 讨论与结论

马铃薯淀粉是一种应用十分广泛的植物淀粉，但在应用方面仍存在一些缺陷，如对热、酸和剪切力敏感等。大量研究表明，瓜尔胶、黄原胶、结冷胶和大豆多糖等非淀粉多糖都会对淀粉的性质产生影响[17-20]。目前，关于豇豆多糖对马铃薯淀粉的影响尚未见报道。因此，本文通过对超声波辅助提取豇豆多糖的最佳工艺参数的研究，为研究其对马铃薯淀粉理化性质、糊化特性及流变特性的影响奠定基础，为扩宽豇豆多糖和马铃薯淀粉复配体系在食品行业的应用提供新思路。