生理和环境因子对甜菜夜蛾性信息素释放及其雄蛾嗅觉反应的影响

姜 策 ，孟 威，郭前爽，张素丽，王兴亚，杜永均

（1.辽宁省绿色农业技术中心，沈阳110034；2.浙江大学农药与环境毒理研究所,杭州310058；3.沈阳农业大学植物保护学院，沈阳110161）

甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]是世界性重要的迁飞害虫[1]，在亚洲、美洲、欧洲、澳洲及非洲均有发生和为害的记录[2]。该种害虫亦是我国为害玉米、甜菜、花生、棉花、白菜、芦笋、花菜、葱、烟草等作物的重要杂食性害虫[3]。近年来，甜菜夜蛾在各地为害逐年加重，其发生的范围有往北扩展的趋势。

甜菜夜蛾的性信息素的鉴定研究最早始于1972 年[4]，其主要成分为顺9 反12-十四碳二烯乙酸酯，但该成分与顺9-十四碳烯乙酸酯的组合在田间没有引诱活性。但加入顺9 顺12-十四碳二烯乙酸酯和顺11-十四碳烯乙酸酯在田间可以诱到雄蛾[5]。真正的突破是1981 鉴定组分为顺9 顺12-十四碳二烯乙酸酯和顺9-十四碳烯醇[6]，日本品系也证明其具有活性[7]，两者的比例为70∶30 或90∶10。这样的信息素混合物开发出的交配干扰技术在田间大葱甜菜夜蛾的防控中应用效果良好。卵、1 龄和2 龄的田间虫口基数可以下降至6%和1%[8]，以及在温室中试验效果也显著[9]。又鉴定了第3 种组分顺11-十六碳烯乙酸酯[10]。在此之后有大量的相关报道，包括嗅觉感觉及延后交配[11]，以及诱捕[12-13]和交配干扰技术[14]。我国甜菜夜蛾性信息素组分被鉴定为顺9 顺12-十四碳二烯乙酸酯和顺9-十四碳烯醇9∶1 的混合物，并从实验室和田间证实了其引诱的有效性[15-16]，一些植物气味还对性信息素的引诱具有增效作用[17]。甜菜夜蛾的性信息素还存在虫源地和地理区系的差异[18]。

目前通常的甜菜夜蛾监测采用杀虫灯及雷达等方法，然而，该虫是远距离迁飞性害虫[19]，其虫源地、日龄、交配等生理状态比较复杂，这些监测方法并不能判断其生理状态，迁飞性害虫的卵巢发育与其迁飞状态有关[20]。性诱监测是一更科学、准确、国际上通用的监测方法[21]，并可以指出其诱捕到的靶标害虫的生理状态和虫源地。但雌蛾性信息素的释放和卵巢发育之间的关系，及其昼夜节律机制和雄蛾的反应，则还没有详细的相关文献[22]。为此，本研究开展的甜菜夜蛾的卵巢发育、性信息素释放、以及地理区系和嗅觉反应昼夜节律之间的关系，为甜菜夜蛾的性诱测报和防控提供基本方案和数据分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

甜菜夜蛾购买于河南省济源白云实业有限公司，将蛹按雌雄分开放置在培养箱中，温度为（25±1）℃，相对湿度为70%±5%，光周期为16L∶8D，17∶00 开始暗期。每日9∶00 收集新羽化出的甜菜夜蛾，放入养虫笼中，并标记羽化日期。将部分成虫按雌雄比1∶1 放置在养虫笼中，待观察到交配时取出。每日16∶00 饲喂10%的葡萄糖水1次。

1.2 方法

1.2.1 精巢和卵巢解剖及精巢体积测定方法 解剖各日龄未交配的甜菜夜蛾雄蛾，比较不同日龄雄蛾精巢体积及交配后的精巢体积，解剖方法参照文献。将甜菜夜蛾的腹部取下后，浸泡在75%酒精中去掉表皮，去除脂肪体后使生殖系统暴露出来。将精巢取出后，利用Motic 显微镜SMZ-168 和照相系统Moticam 2506(麦克奥迪，厦门)拍照，使用软件Motic Plus Images 2.0测量雄性精巢的赤道半径（a，b）及半径c的长度，根据椭球体积公式V=4πabc/3计算精巢体积。

取雌蛾将卵巢解剖出来，去除脂肪体后观察卵巢管的颜色及卵的成熟情况，参照韩兰芝等[23]方法确定卵巢等级：透明期(I)、卵黄沉积期(II)、成熟待产期(III)、产卵盛期(IV)和产卵末期(V)。

1.2.2 性信息素提取和鉴定、定量方法 每日提取单个未交配雌性甜菜夜蛾性信息素，在暗期6h，取出雌蛾轻轻挤压腹部，暴露性腺后剪下性腺，用滤纸吸去水分后，放置在色谱瓶中，加入50μL正己烷，浸提1h后，将正己烷吸出，加入10μL十八烷（0.1mgˑL-1）作为内标。重复6次，氮气浓缩。取2日龄未交配雌蛾进行性信息素释放昼夜节律试验。

气质联用仪采用安捷伦6890GC-5975MS并配有DB-FastFAME毛细管柱(60m×0.25mm×0.25μm)。程序升温:60℃停留1min，然后每分钟升温10℃至180℃，之后每分钟升温3℃至210℃，之后每分钟升温10℃至250℃维持10 min。离子源温度为230℃，能压70eV，载气为氦气。通过软件计算各个性信息素及内标的峰面积，根据性信息素峰面积与内标峰面积的比例计算性信息素的相对质量。

1.2.3 田间诱蛾昼夜节律记录方法 采用宁波纽康生物技术有限公司生产的新型害虫自动监测工具“赛扑星”昆虫性诱电子智能测报系统（SPT-N-02）监测每日、每小时田间诱蛾动态。性诱智能测报系统每隔1h发送1次数据。赛扑星性诱智能测报系统同时记录了当日每个小时诱捕器周围的温度和湿度。监测系统设置于江苏省盐城市大丰市大丰区绿生源农场(120.35°E，33.16°N)和河北省唐山市丰南区大岭子村(118.30°E，39.43°N)。

1.3 数据分析方法

试验所得数据结果采用SPSS 17.0 软件进行分析。多组比较采用One-way ANOVA 法，显著性分析采用LSD 法，两组平均数间显著性差异比较采用Student 氏t 检验法。利用Pearson 相关系数进行相关性分析，相关性分析的显著性用双尾t检验分析。回归分析采用线性回归法。显著性分析时p值大于0.05 表示差异不显著，小于0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 甜菜夜蛾卵巢的发育

将单独饲养雌性成虫，每日解剖观察其卵巢等级。1日龄雌性成虫卵巢已经发育至卵黄沉积期(II)，3日龄到达成熟待产期(III)，6日龄出现产卵盛期(IV)。至9日龄IV占比达到最高为66.7%。透明期(I)仅在5日龄时发现1只，产卵末期(V)未发现（表1）。

表1 不同日龄甜菜夜蛾雌蛾的卵巢发育Table 1 The ovarian development of the female beet ar‐myworm at different days

2.2 甜菜夜蛾性信息素主要成分的日龄变化

甜菜夜蛾性腺提取物中，主要成分为Z9-14:Ac,Z9E12-14:Ac 和Z11-16:Ac，其相对含量随日龄增加而降低，9 日龄时相对含量为0。Z9-14:Ac 的含量随日龄增加变化不明显，各日龄间无显著性差异。1 日龄甜菜夜蛾Z9E12-14:Ac 相对含量为（2.30±0.46）ng，7 日龄为（2.72±1.09）ng，显著高于与其他龄期，9 日龄时相对含量为0。Z11-16:Ac 只在3，4 日龄时检测到，4 日龄时含量达到最高，相对含量为（1.87±1.01）ng（图1）。

图1 不同日龄甜菜夜蛾雌蛾性信息素组成和含量Figure 1 Sex pheromone composition and contents of female Spodoptera exigua at different days

2.3 甜菜夜蛾性信息素主要成分的昼夜节律

甜菜夜蛾的各个性信息素组分，暗期都能检测到。Z9-14:Ac、Z9E12-14:Ac 在暗期开始后释放量逐步增加，在23∶00时达到最高。与之相比较，Z9-14:OH 在暗期开始时也可检测到，在21∶00时含量最高，而后逐渐减少，1∶00时已检测不到。Z11-16:Ac 在 23∶00 时出现。只在 23∶00 时出现 4 种主要成分同时存在。值得注意的是，19∶00 时各种成分都没有检测到，而17∶00反而检测到性信息素组分。从相对含量来看，Z9-14:Ac 和Z11-16:Ac含量最高（图2）。

图2 甜菜夜蛾雌蛾性信息素主要成分释放的昼夜节律Figure 2 The circadian rhythm of the main compo‐nents of sex pheromone released by the female beet armyworm moths

2.4 甜菜夜蛾雄蛾的精巢与日龄的关系

日龄对甜菜夜蛾雄性精巢体积有显著性影响（p＜0.001），随日龄的增加精巢体积呈逐步减少的趋势，1日龄精巢体积为（2.29±0.30）mm3。2日龄精巢体积为（1.32±0.33）mm3。1 日龄与2 日龄间存在显著性差异。6 日龄精巢体积为（2.29±0.30）mm3。10 日龄的精巢体积仅为（0.22±0.04）mm3。6 日龄至10 日龄精巢体积无显著性差异。此外，精巢体积与雄蛾日龄之间存在极显著线性相关性(R= -0.836,p＜0.001)，对精巢体积与日龄进行线性回归分析，得到回归方程y=-0.185x+1.808 (R2=0.716,p＜0.001)。交配对精巢体积没有影响（图3）。

图3 不同日龄（A）和交配前后（B）的甜菜夜蛾精巢体积变化Figure 3 The testis volume of beet armyworm at different ages (A) and before and after mating (B)

2.5 田间雄蛾对性信息素嗅觉反应的昼夜节律

图4 唐山和盐城2个性诱智能测报系统的诱蛾量昼夜节律变化Figure 4 Circadian rhythm of hourly moth catches by pheromone trapping in the Smart Monitoring and Reporting Systems by pheromone trapping in Tangshan and Yancheng

对田间实时性诱智能测报系统的数据分析可知，甜菜夜蛾雄蛾对性信息素的反应有显著的昼夜节律（图4），但不同季节和不同地域差异显著。在河北唐山地区，7 月底至8 月上旬的一个诱蛾小峰阶段，诱蛾时间段在19∶00～5∶00，高峰时间在3∶00～4∶00，而9～10月高峰时间在2∶00～3∶00。7～9月都只有1个诱蛾高峰。9月底至10 月下旬的时段，诱蛾时间段扩大至16∶00～6∶00，其中有2 个峰（18∶00～19∶00 和2∶00～3∶00）。在江苏盐城地区，6 月上旬的1 个诱蛾阶段，诱蛾时间段也在19∶00～5∶00，高峰时间在3∶00～4∶00，而9～10 月高峰时间在2∶00～3∶00。7～9月都只有1个诱蛾高峰。9月底至10月下旬的时段，诱蛾时间范围扩大至17∶00～6∶00，其中有2个峰即18∶00～19∶00和3∶00～4∶00，第1个小高峰并不明显。相比唐山，盐城点的诱蛾高峰期时间较短。

2.6 温湿度与田间雄蛾对性信息素反应的关系

温湿度与性信息素的诱捕密切相关，二个监测点的分析结果发现，单一的温度和湿度与诱蛾量之间没有相关性，但温度和湿度的组合与诱蛾量之间有显著的正相关（图5）。

图5 诱蛾量与温湿度之间的相关性（A.唐山；B. 盐城）Figure 5 Correlation between moth catches by pheromone trapping and temperature as well as humidity(A. Tangshan; B. Yancheng)

3 讨论与结论

昆虫的求偶行为涉及雌蛾性信息素的释放和雄蛾的嗅觉反应。雌蛾的性信息素生物生物合成和释放受诸多因素的影响。其中，日龄显著影响雌蛾发育，特别是卵巢发育，性信息素释放只有在性成熟、可以交配时释放[24]。雄蛾通过影响昆虫嗅觉基因表达，从而影响嗅觉反应谱[25]，最终影响昆虫的发情与交配行为。甜菜夜蛾成蛾在羽化后即可交配[2]，雌蛾在羽化后1 日龄就有较高的性信息素释放，而且卵巢分级达到Ⅱ级。交配对甜菜夜蛾雌蛾性信息素各组分的滴度、比例及其在个体间的变异均无显著的影响,因此交配不影响雌蛾在下一暗期的再次求偶和交配。本研究结果表明交配对雄蛾的精巢体积也没有影响。

甜菜夜蛾的性信息素释放也具有昼夜节律变化。雄蛾对性信息素的反应也有昼夜节律，成虫一天中的交配时间出现于23∶30 ～05∶30，交配高峰出现在01∶30～02∶30 和03∶00～04∶00[2]，而性信息素的释放则早于交配时间，可以推测性信息素的释放时间与求偶行为时间比较一致。顺9 顺12-十四碳二烯乙酸酯和顺9-十四碳烯醇被认为是我国甜菜夜蛾性信息素成分[26]，顺9 顺12-十四碳二烯乙酸酯和顺9-十四碳烯醇的释放时间很短，而且高峰期在时间上也不一致。从相对含量来看，Z9-14:Ac 和Z11-16:Ac 反而最高，这2 个组分在之前的报道中并没有被鉴定出是我国甜菜夜蛾的性信息素组分之一[15]，其释放时间与主成分也不同步，这可能是各种报道没有完整鉴定全组分的一个原因。从实验室的数据来比较，日龄与求偶的起始时间和昼夜节律有关系[26]。结合田间监测的甜菜夜蛾性信息素诱捕昼夜节律数据，从雌雄两者释放和接收的时间段来比较，雄蛾接受性信息素气味分子的嗅觉反应时间范围相对比较宽。人工合成的性信息素是通过缓释材料诱芯释放气味分子在田间扩散，因此，在田间诱芯是24h整天、不间断释放，并借助于气流的扩散、传播，而田间自然雌蛾只有在晚上某一特定时间段释放性信息素求偶，在时间和范围上都有一定的局限性，因此，诱捕器在诱捕甜菜夜蛾雄蛾的时间段上具有竞争上的优势。这也是性诱测报和防控效率高的原因之一。

环境温度不仅影响自然雌蛾性信息素的生物合成和释放[27]，还对诱捕器中诱芯的合成性信息素化合物的稳定性和释放速率产生影响，也就是与诱芯在田间的持效期密切相关，同时，也影响雄蛾的交配、飞行活性。每一种昆虫都有其特定的适宜生存和活动的温度范围，在适宜温度环境下，昆虫比较活跃，飞行范围大，对性信息素的反应也比较敏感。已有报道表明，15～25℃最有利于甜菜夜蛾性信息素的产生，而10℃低温和35 ℃高温则使性信息素产生受到明显影响，其中以10℃低温的影响更甚。10 ℃低温处理不仅使各组分的滴度产生显著改变，而且使二元性信息素组分的比例受到显著影响。水与羽化后的蛾子关系密切，鳞翅目成虫不一定需要补充营养，但需要水[28]，可以理解湿度在蛾子活动中的重要性。本研究中田间环境温度与性诱蛾量相关性并不显著，但与温度和湿度的组合关系显著，说明在一定适宜温度范围内，高温及高湿下的诱蛾量增加。

在传统测报中，对于稻纵卷叶螟、粘虫、甜菜夜蛾等迁飞性害虫的监测，需要通过解剖卵巢，观察卵巢的发育状态和分级，进而推断其迁飞性和可能的危害，这样的测报方法工作量大，既不方便，又需要专业人士才能具体操作。通过开展灯诱和性诱测报方法，可以大大降低工作强度，提高测报准确性，而灯诱与性诱之间不是一个简单的线性关系，一般越冬代灯诱效果较差，无法通过灯诱监测到蛾峰，灯诱的雄蛾和雌蛾生理状态区分也比较困难，开展性诱监测，可以有效解决这样的问题。本试验证实了甜菜夜蛾卵巢发育与性信息素合成和释放比较吻合，通过甜菜夜蛾生理状态和环境因子分析了雌蛾卵巢发育、性信息素释放与雄蛾诱捕之间的关系，为性诱预测预报甜菜夜蛾的发生提供了理论基础。