荞麦蜂花粉多糖对人体粪便菌群代谢的影响

李 娟，邓泽元，范亚苇

（南昌大学 南昌330047）

荞麦蜂花粉是蜜蜂从荞麦花药中采集花粉，经储存和发酵形成的花粉团，含有丰富的营养物质和活性成分，被称为“微型营养库”，多糖是其重要的组成部分之一。天然来源的多糖作为一种重要的生物活性物质，具有抗氧化、降血压、提高免疫力、调节胃肠等多种作用[1-2]。近年来，已有对荞麦蜂花粉多糖的抗氧化，提高免疫，降血脂等活性功能的研究[3-4]，而未见对荞麦蜂花粉多糖的体外发酵行为及对肠道菌群的影响报道。肠道菌群是定值在人体胃、肠道微生物的总称，约有1 000 多种，数量达1013～1014，是人体体细胞数量的10 多倍[5]。最近研究表明，肠道菌群不仅具有调节肠道功能、促进消化吸收、提高免疫力等被人熟知的作用，还具有调节脑-肠影响宿主的脑功能和行为能力等作用[6-8]。由于人体缺乏碳水化合物活性酶，大多数非消化性多糖不能被人体消化吸收，因此主要通过肠道微生物群落发酵来发挥生理活性作用[9]。人体新鲜粪便中的菌群种类及组成与人体肠道内的菌群较为相似，可通过研究多糖在粪便菌群的发酵行为来表征肠道菌群。目前对于多糖对肠道菌群作用的研究多采用体外发酵模型和动物实验，相比动物实验，体外发酵试验更为经济且易控制试验参数，并可多次重复试验，是研究不同化合物与肠道菌群相互作用的重要工具[10]。

多糖的对人体肠道菌群的作用与其酵解后产生的代谢产物密切相关，尤其是酵解过程中短链脂肪酸的组成情况[11]。多糖在肠道内被菌群酵解产生乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸，短链脂肪酸（SCFAs）可作为肠道上皮细胞的能量来源，保护肠道黏膜[12]，具有调节肠道菌群、抗炎、抗肿瘤、调节免疫应答等功能[13]。同时短链脂肪酸的生成会降低环境中pH 值，形成酸性环境，维持电解质平衡，促进有益菌的生长[14]。通过分析多糖酵解过程的代谢行为及代谢产物，可反映多糖对肠道菌群的影响。本研究通过建立体外发酵模型，分析不同浓度荞麦蜂花粉多糖对人体粪便微生物菌群代谢产物的影响，探究荞麦蜂花粉多糖的益生元作用，为今后荞麦蜂花粉多糖与肠道菌群的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦蜂花粉，购自山西蜂农；苯酚、水杨酸钠、亚硝基铁氰化钠，大茂化工试剂厂；次氯酸钠，天津市永大化学试剂有限公司；偏磷酸，上海振兴化工一厂；菊糖（分析纯级）、短链脂肪酸（乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、正戊酸）系列标准品，上海阿拉丁试剂有限公司。发酵培养液中各试剂均为分析纯级。

1.2 主要仪器与设备

Bio-Tek 酶标仪，美国伯腾有限公司；Agilent68990N 气相色谱仪，安捷伦科技有限公司；pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；YQX-Ⅱ厌氧培养箱，上海龙跃仪器设备有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械公司。

1.3 试验方法

1.3.1 荞麦蜂花粉多糖的制备 称取适量破碎完全的荞麦蜂花粉，置于50℃、90%乙醇溶液中回流脱脂1 h，自然晾干后于90℃去离子水中浸提4 h，离心取上清液，减压浓缩后加入4 倍体积无水乙醇醇沉。采用木瓜蛋白酶-Sevag 法除蛋白，透析、冷冻干燥即得荞麦蜂花粉多糖，命名为WFPP。采用苯酚-硫酸法测定中性糖含量，间羟基联苯法测定糖醛酸含量，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。

1.3.2 多糖单糖组成分析 参照文献[15]方法测定荞麦蜂花粉多糖单糖组成，WFPP 经三氟乙酸溶液水解为多糖，之后对水解产物进行糖精乙酸酯衍生处理，衍生物用气相色谱分析。

1.3.3 多糖体外发酵

1.3.3.1 培养基配制 按文献[16]方法分别配制微量培养液和衡量缓冲液，2 种溶液按体积比1∶100 的比例混合，即发酵培养液。

1.3.3.2 体外酵解收集3 名志愿者的新鲜粪便（志愿者无胃、肠道疾病且至少3 个月内未服用抗生素），分别从志愿者粪便中取等量粪便混合，按固液比1∶5 加入发酵培养液，均质化后用4 层无菌纱布过滤，收集滤液即人体粪便接种物，备用。

将荞麦蜂花粉多糖及菊糖按一定比例分别加入发酵培养液中进行体外发酵。对于测试的样品，最终的酵解体系组成为50%酵解培养基，50%人体粪便液，将发酵液转移至厌氧密封管中，在厌氧体系中（80%N2、10%CO2、10%H2）37℃酵解培养48 h。试验分为5 组，以不添加多糖为空白对照组（CK 组），以菊糖为阳性对照组（菊糖组），培养液中菊糖含量为2.5%；多糖组分为低、中、高3 个水平（WFPP-L 组、WFPP-M 组、WFPP-H 组），各组培养液中糖含量分别为2.5%，5%，10%。

1.3.4 发酵液中pH 值的测定 在酵解0，6，12，18，24，36，48 h 时收集样品发酵产物，迅速浸入冰水中停止发酵。离心后取上清液即发酵液，用精密pH 仪测定其pH 值。

1.3.5 总糖消耗率的计算取1.3.4 节收集的发酵液，采用苯酚-硫酸法[17]测定其总糖含量，计算发酵过程中多糖消耗率。

1.3.6 发酵液中NH3-N 含量的测定 发酵液中NH3-N 含量计算参照胡伟莲[18]的方法，采用水杨酸-次氯酸钠比色法测定发酵产物中NH3-N 含量。称取适量氯化铵溶于盐酸，配制系列浓度的氨氮标准溶液，样品处理后于波长700 nm 处测定吸光值，根据标准曲线计算发酵液中NH3-N 含量。

1.3.7 发酵液中短链脂肪酸含量的测定 采用气相色谱法[19]测定发酵液中短链脂肪酸的含量。取离心后的发酵液，按体积比4∶1 加入25%偏磷酸，涡旋混匀后离心，取上清液，待测。

色谱条件：Agilent68990N 气相色谱仪，FFAP柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），FID 检测器。升温程序：设置初始柱温100℃，保持1 min，然后以4℃/min 升至180℃，之后以20℃/min 升至200℃，维持5 min。设置检测器和进样口温度分别为240℃和200℃，载气、燃气分别为N2、H2。N2、H2及空气流速分别为2，30，300 mL/min，不分流进样，进样量1 μL。通过样品峰面积与标准品对比来计算脂肪酸含量。

2 结果与分析

2.1 多糖的单糖组成

荞麦蜂花粉经脱脂、水提醇沉、除蛋白、透析、冻干等处理，得到其多糖WFPP，得率为4.31%。测得其中性糖含量为59.48%、糖醛酸含量11.0%，蛋白含量1.31%，水分含量9.15%。

WFPP 单糖气相色谱图及各单糖组成情况见图1和表1。WFPP 主要由Rha、Ara、Xyl、Man、Glc、Gal 等单糖组成，它们物质的量比为2.84∶34.57∶1.69∶1.12∶27.11∶30.84。WFPP 主要由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖单糖组成，3 种单糖总含量达92.52%，含有少量的鼠李糖、木糖、甘露糖。其中阿拉伯糖与半乳糖的比例约为1∶1，推测WFPP由阿拉伯半乳聚糖。碘-碘化钾试验为阴性，提取的多糖中无淀粉组分，同时WFPP 中葡萄糖含量较高，表明WFPP 中含有葡聚糖。由此可推测WFPP 主要由阿拉伯半乳聚糖和葡聚糖组成，这与从大利[20]的研究结果一致。

图1 WFPP 单糖气相色谱图Fig.1 GC chromatogram of WFPP monosaccharides

表1 WFPP 单糖组成Table 1 Monosaccharide composition of WFPP

2.2 发酵液pH 值的变化

pH 值是反映多糖在酵解过程中被人体肠道菌群利用程度的重要指标[21]。如图2所示，除空白组外，其它4 组发酵液pH 值随发酵时间的延长而降低，pH 值变化主要发生在发酵前18 h 内。酵解48 h 后，CK 组的pH 值从最初的7.49 降到7.33，无明显变化；菊糖组pH 值降至6.12；WFPPL、WFPP-M 和WFPP-H 组pH 值分别降低至5.73，5.3，4.64，相较CK 组和菊糖组，发酵前、后多糖组pH 值显著降低。整个发酵过程中，荞麦蜂花粉多糖培养物中的pH 值始终低于空白组及阳性对照组，发酵18 h 时WFPP-H 组发酵液pH 值已降至4.54，且WFPP 添加量越大，发酵液pH 值降幅越明显。陈春[22]发现桑葚多糖在体外酵解过程中随着酵解时间的延长培养物中pH 值降低，与本研究结果一致。酵解过程中多糖被肠道中双歧杆菌等菌群利用产生乙酸、丙酸等短链脂肪酸，降低培养液pH 值，同时环境中pH 值的变化也影响短链脂肪酸的生成和肠道微生物组成[23]。肠道pH 值的降低会使肠道形成一个酸性环境，抑制有害菌的繁殖，促进有益菌的生长。另一方面pH 值也影响肠道微生物的酶活性，对人体肠道健康具有积极作用。

图2 体外发酵过程中发酵液pH 值的变化Fig.2 The change of pH values of fermentation broth during in vitro fermentation

2.3 发酵液中总糖消耗率的变化

整个发酵过程中，各组发酵液中总糖含量均不同程度降低。尤其在发酵0～18 h 期间，总糖含量下降趋势最为明显。相较菊糖组，WFPP 主要在0～6 h 被消耗，发酵6 h 后WFPP 组总糖消耗率达50%，发酵18 h 后，WFPP-L、WFPP-M 及WFPPH 各组糖质量浓度分别为0.29，0.41，0.56 mg/mL，此时发酵液中糖含量较低，与空白组0.27 mg/mL相似，WFPP 基本被肠道菌群消耗。菊糖主要在6～12 h 被微生物降解利用，发酵6 h 后菊糖中总糖消耗量仅增加14.22%，酵解12 h 后，消耗率为69.18%。发酵24 h，发酵液中WFPP 基本被消耗，在发酵24～48 h 期间糖含量无显著变化，表明人体粪便肠道菌群主要在发酵前期酵解荞麦蜂花粉多糖，在培养液中添加不同剂量的荞麦蜂花粉多糖，均能被菌群较好的消化利用。

不同碳水化合物的降解程度及被肠道菌群的消耗速率存在差异，原因可能与多糖的组成及理化性质有关，如单糖组成、聚合度、侧链分布及空间构像等，多糖的溶解度、黏度也会影响多糖被粪便菌群酵解的效果[24]。有文献报道，某些膳食纤维、菊糖在体外发酵24 h 后，90%以上能被粪便菌群消耗掉，而麦芽糊在酵解过程中利用率低于50%[25]。车前子多糖在酵解24 h 后碳水化合物消耗量为47.2%，相同发酵时间内豌豆纤维仅有20%被肠道菌群酵解利用[26]。

2.4 发酵液中NH3-N 含量

如图4所示，发酵0～12 h，CK 组、菊糖组及WFPP-L 组培养液中NH3-N 含量随着时间的延长而持续增加，而WFPP-M 及WFPP-H 两组NH3-N 的含量逐渐降低。发酵12 h 时，WFPP-H组发酵液中NH3-N 含量达到最低值17.75 mg/mL。发酵12～48 h，各组发酵液中NH3-N 含量均上升，WFPP-H 组NH3-N 含量增幅及质量浓度均明显低于其它4 组，其次是WFPP-M 组。发酵0～48 h，空白组发酵液中NH3-N 含量逐渐增加，且始终高于其它4 组。添加荞麦蜂花粉多糖能降低培养液中NH3-N 含量，添加量越高效果越明显，高剂量多糖在发酵12 h 时能显著抑制菌群产生NH3-N。

氨态氮是酵解过程中外源蛋白质和内源含氮物质降解的重要产物。一般情况下，NH3-N 含量处于动态平衡，受环境中蛋白降解度、微生物的合成速度及NH3-N 吸收利用等因素的影响。环境中NH3-N 含量过高，易引起氨中毒[18]。发酵0～12 h，粪便菌群主要酵解多糖生成短链脂肪酸，形成酸性环境，有利于肠道有益微生物的生长，提高对氨的利用。随着发酵时间的延长，培养物中多糖逐渐被消耗，在此过程中主要进行蛋白发酵，产生氨、胺及吲哚等物质，培养液中NH3-N 逐渐积累[27]。

图3 不同发酵时间点发酵液中糖含量Fig.3 Total carbohydrate at different time points during fermentation

图4 不同发酵时间的培养液中NH3-N 含量Fig.4 The content of NH3-N in culture medium of different fermentation time

2.5 发酵液中短链脂肪酸含量的变化

乙酸、丙酸、正丁酸是体外发酵形成的主要短链脂肪酸，是多糖体外酵解的典型代谢产物。除这3 种主要SCFAs 外，在发酵过程中还产生少量的异丁酸、正戊酸、异戊酸，是由蛋白质发酵产生。整个发酵过程中，WFPP 组酵解培养物中的SCFAs含量始终高于CK 组。除CK 组外，各组发酵液中乙酸、丙酸、正丁酸及正戊酸的含量整体上是增加的，异丁酸、异戊酸含量无明显变化，且与CK 组没有显著差异。发酵0～24 h，各组发酵液中乙酸含量显著升高，WFPP-H、WFPP-M、WFPP-L 及菊糖组分别从最初的4.89，4.25，4.12，3.63 mmol/L增至46.17，23.91，12.44，6.56 mmol/L；各组中丙酸含量从最初1～2 mmol/L 升至17.86，10.76，6.03，1.66，1.36 mmol/L。WFPP-H、WFPP-M、WFPP-L及菊糖组的正丁酸从最初0.94，0.87，1.13，0.71 mmol/L 升至12.24，4.50，2.08，0.71 mmol/L。发酵24～48 h，各组代谢产物中乙酸、丙酸、丁酸含量无明显变化，发酵36～48 h，其含量出现小幅下降，可能是随着发酵时间的延长培养基中菌群大量繁殖，酵解产生的短链脂肪酸被菌群利用，短链脂肪酸逐渐被消耗，因而其含量不再增加，甚至出现下降。

图5 发酵过程中不同时间点发酵液SCFAs 浓度的变化Fig.5 Changes of SCFAs concentration at different time points in fermentation cultures

SCFAs 是胃、肠道中厌氧微生物发酵产生的最终代谢产物，易被人体吸收，被认为是宿主肠道的重要能量来源[28]。乙酸是拟杆菌门的主要代谢产物，能够进入外周循环而被外周组织代谢；丙酸通常被肝脏代谢，可抑制胆固醇的合成，并作为结肠上皮细胞的能量来源，起到缓解慢性肠道炎症的作用；丁酸是一种主要由厚壁菌门产生的有益代谢物，能抑制去乙酰化酶活性，调节宿主基因表达，在缓解炎症、减少结肠癌等方面发挥着重要的作用[29]。SCFAs 通过调节宿主代谢组织中SCFAs受体和靶分子表达参与宿主生理反应，乙酸、丙酸、丁酸均可结合并激活免疫细胞主要受体GPR41、GPR43，丁酸及β-羟基丁酸对GPR109 也有激活作用[30]。Wang 等[31]发现嗜酸乳杆菌可增加β-乳球蛋白致敏小鼠粪便短链脂肪酸浓度，通过诱导致敏小鼠脾脏和结肠中SCFAs 受体GPR41、GPR43 的表达，减轻小鼠过敏性炎症反应。Furusawa 等[32]提出短链脂肪酸可通过抑制调控基因表达蛋白HDACs 活性，促进Foxp3 表达，从而调控Tregs 的分化与功能，影响机体免疫相关性疾病的进展。

3 结论

通过分析不同发酵时间发酵液中pH 值、总糖、NH3-N 及短链脂肪酸含量变化，探究荞麦蜂花粉多糖在人体粪便中的发酵规律，揭示不同剂量荞麦蜂花粉多糖对人体粪便菌群的影响。结果显示：随着发酵时间的延长，发酵液中pH 值逐渐降低，WFPP 的添加量越高，pH 值下降明显。荞麦蜂花粉多糖主要在发酵前24 h 被粪便菌群酵解利用，体外发酵24 h 后，发酵液中WFPP 消耗量均在80%以上；酵解12 h 后，添加中、高剂量的WFPP 可明显降低培养液中的NH3-N 含量。除此之外，乙酸、丙酸、正丁酸是粪便肠道菌群酵解荞麦蜂花粉多糖生成的主要短链脂肪酸，其主要在发酵0～24 h 产生，这与多糖在发酵过程中的变化规律一致，且WFPP 添加量越高，酵解产生的短链脂肪酸越多。综上所述，荞麦蜂花粉多糖在肠道中可被人粪便菌群酵解利用，产生的SCFAs 等代谢产物对肠道菌群有积极作用，有利于人体健康。