多条件在线光度法测定桑葚色素稳定性

张凯龙，倪貌貌，顾 玮，宋亚萍，郭 斌，汪财生

（1 浙江万里学院生物与环境学院 浙江宁波315100 2 宁波鄞州中铭农业科技有限公司 浙江宁波315100）

天然色素具有安全性高、营养丰富、色调自然等优点，在消费市场具有极高的认可度[1-2]，目前已建立多种色素检测分析方法[3-4]。桑葚富含花色苷类化合物，色彩鲜艳，色价高，以其为原料提取的色素，可广泛应用于高端食品、日用品、化妆品和药品等领域。近年来的研究表明天然色素具有一定的生理活性[5-10]，具有巨大的开发利用潜力。

桑葚成熟期气温高，成熟集中、果期短，采摘不便，贮存困难，易造成巨大浪费和环境污染。开展桑葚色素高值化利用研究，拓展利用途径，提高产品附加值，对促进农业增收具有重要意义。目前，关于桑葚色素热稳定性的研究较多，但结果差异较大。光、包装材料、氧化剂及添加剂等对桑葚色素稳定性影响的研究较少，且普遍使用定性描述，因此建立桑葚色素稳定性准确、全面的定量描述极为必要[11-13]。

目前，天然色素稳定性研究中多采用单条件控制、手动离散取样测定方案，劳动强度大，样品容易受到污染，测定准确性较差，不便于考察多种条件如温度、光照、pH 值、氧化、添加剂等对稳定性的影响[14-17]。本研究开发了一种多条件控制在线光度法实时动力学测定装置，基于该装置采用初始动力学方法测定桑葚色素稳定性。本研究结果为桑葚色素开发利用提供技术支持，为天然色素稳定性研究提供新的测试方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

甲酸、氢氧化钠、乙酸、三水乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、过氧化氢、维生素C（分析纯级），国药集团化学试剂有限公司。

桑葚由宁波鄞州中铭农业科技有限公司提供，成熟果实，外观呈紫黑色。

1.2 设备与仪器

SCIENTZ-18N 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；GX-3020 型恒温循环器，宁波海曙亿恒仪器有限公司；DC-1006 型低温恒温槽，宁波天恒仪器厂；FE20 型pH 计，梅特勒-托利多集团；78-1 型磁力搅拌器，金坛大地自动化仪器厂；Model 910-0025 型蠕动泵，赛默飞世尔公司；5 W 紫外灯（主波长254 nm），广东雪莱特光电科技有限公司；ULTRA-VITALUX 型日光模拟灯（标识功率300 W，其中波长315～400 nm 的辐射功率13.6 W，波长280～315 nm 的辐射功率3.0 W），欧司朗（中国）照明有限公司；400 μL 流动比色皿，宜兴市谱析光学元件有限公司；UV3200PCS 型紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；2 mm 厚石英玻璃、2 mm 厚光学玻璃、1 mm 厚棕色光学玻璃，宜兴市谱析光学元件有限公司；0.15 mm 厚PET 平板，剪裁于市售大包装农夫山泉纯净水瓶平坦部分。

1.3 试验方法

反应器有效容积100 mL，连接管路长度约60 cm，连接管内径1.6 mm，管路及流动比色皿体积约1.6 mL。

桑葚果肉水提液过大孔树脂，合并色素洗脱液冷冻干燥，所得粉末为桑葚色素混合物，以缓冲溶液配制桑葚色素储备液。

移取一定量桑葚色素溶液加入反应器，设置控制条件，采集吸光度数据，采样间隔1 min，总时长5 h。桑葚色素降解反应速率常数较低，5 h 测定为其初始动力学数据。

2 结果与分析

2.1 多条件在线光度法动力学数据采集装置

如图1所示，装置主要由7 部分组成。反应器为具有色素溶液流入流出接口的夹层烧杯，夹层通入恒温循环水保持体系温度稳定。反应器下方设置有磁力搅拌器，上方设置有光线阻隔材料平板，平板上方为外置光源，反应器内筒中色素溶液在蠕动泵驱动下流经流动比色皿-分光光度计检测器测定后流回循环。

图1 多条件在线光度法动力学试验装置Fig.1 Multi-conditions controlled online spectrophotometry experimental device for kinetics study

装置管道及比色皿存在一定“死体积”，对反应器内样品施加实时“非全体性”影响时（如光照），理论上存在微小延迟，通过延迟动力学方程可予以消除，-dcp/d（t-τ）=kAmP，τ为“死体积”对应延迟时间（h）。当反应速率常数较低、“死体积”远小于反应器容积、蠕动泵快速循环时，流动比色皿内溶液和反应器内溶液视为等效。

试验装置适用于慢速液体均相动力学过程初始、全程实时数据自动在线采集。测定天然色素褪色动力学时，向反应器内加入色素溶液，设置循环水温度、pH 值、外置光源、光线阻隔材料平板、添加物种类和浓度等一种或多种条件组合，开启搅拌和蠕动泵，分光光度计设置为动力学模式，检测波长为色素溶液最大吸收波长，设置采样间隔，采集数据。

温度20℃，以去离子水为参比，在反应器内加入去离子水循环1 h，吸光度最大差值ΔAmax=0.0021，表明试验装置及测量系统噪音极低，具有良好的稳定性。

2.2 桑葚色素酸碱稳定性

桑葚色素用pH 值为3，4，5，6，7，8 的缓冲溶液稀释，在波长400～800 nm 范围内进行扫描，结果如图2所示，溶液颜色如插图所示，pH 值对桑葚色素颜色影响明显。pH 值为3 时溶液中桑葚色素呈现纯正红色，鲜艳浓厚，适用于食品、药品、化妆品等产品调色，是桑葚色素最佳酸碱环境，最大吸收波长514 nm。pH 值从3 增大为8 时，对应最大吸收波长红移，红色变浅并逐渐转变为暗红色、红棕色，颜色劣化，感官评价变差。

图2 不同pH 值桑葚色素颜色Fig.2 Color of mulberry pigments at different pH value

pH 值为3 时，以吸光度A0=0.968 的桑葚色素溶液为储备液，分别移取0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 份储备液稀释到1 份，吸收光谱无变化，稀释曲线线性良好，如图3所示。色素降解过程中在波长514 nm 处监测吸光度的变化。

图3 pH 值为3 时桑葚色素溶液稀释曲线Fig.3 Dilution curve of mulberry pigment at pH 3

2.3 桑葚色素热稳定性

在室内自然光照，pH 值为3，反应体系温度分别为20～80℃，吸光度变化如图4a所示。由图4a 可知，20～50℃吸光度下降缓慢，20℃时桑葚色素吸光度5 h 仅降低0.004，主要为系统噪音贡献，60℃开始吸光度降速增加，并随温度升高加剧。对图4a 吸光度变化进行一次动力学拟合，结果如图4b所示，拟合反应速率常数及相关系数见图4a 插表，20℃时吸光度变化过小，因噪音掩盖失真，相关系数低，仅作为参考。30℃反应速率常数k30℃=0.0023 h-1，半衰期τ30℃=301.4 h，80℃反应速率常数k80℃=0.0492 h-1，半衰期τ80℃=14.1 h，表明桑葚色素对温度敏感，20℃及以下温度冷藏能长期保持颜色稳定，温度过高会加速花色苷破坏。

对不同温度反应速率常数按照阿伦尼乌斯方程ln（k）=lnA-Ea/（RT）拟合，如图4b 插图所示，表观活化能Ea=60.2 kJ/mol，较大的活化能表明桑葚色素降解较为缓慢。温度对色素稳定性影响体现在2 方面：一方面温度会影响氧化、还原、光解过程反应速率常数，另一方面升高温度使花色苷分子自身热分解更加显著。因此，温度对于色素稳定性极为关键，在生产、贮存、运输、货架等环节注意保持低温。

图4 桑葚色素热稳定性Fig.4 Thermal stability of mulberry pigments

2.4 桑葚色素光稳定性

20℃条件下，反应器加盖石英玻璃片，分别在距液面30 cm 和10 cm 处设置日光模拟灯和紫外灯，吸光度变化如图5所示，一级动力学拟合见图5内插图、表。日光模拟灯功率较大，然而灯光呈锥状发散从而仅有部分投射到色素液面；紫外灯功率小，但光线较为集中，计算ksun=0.0152 h-1、kuv=0.0181 h-1，较为接近，同时也表明光照，特别是紫外光会加速色素降解。紫外光能量较高，与共价键键能较为接近，紫外线暴露将破坏花色苷分子结构，发生褪色。

图5 桑葚色素光稳定性Fig.5 Light stability of mulberry pigments

包装材料是色素相关产品需要考察的重要因素，需尽可能平衡产品展示感官和避光需求。选用常用的石英玻璃、光学玻璃、棕色光学玻璃、PET材质平板，在波长200～800 nm 处测定其透射光谱（图6）。在20℃，距液面30 cm 处设置日光模拟灯，不同光线阻隔材料下桑葚色素降解曲线如图7所示，一级拟合动力学见图7插图、表。

图6 不同材料透光率Fig.6 Transmittance of different materials

图7 不同阻隔材料下桑葚色素的光稳定性Fig.7 Light stability of mulberry pigments under different barriers

石英在波长200～800 nm 区间内全透过，仅在波长接近200 nm 处的低波长高能紫外线透过率略有下降，相应色素降解速率最大。光学玻璃和PET 均有良好的可见光透过性，当波长低于350 nm 时，近紫外线透光率快速下降；当波长在300 nm 左右，透光率降为零，表现出较好紫外线屏蔽能力。PET 透光波长及强度都略低于光学玻璃，相应反应速率常数也较低。由于日光模拟灯低波长紫外区功率较低且照射分散，因此使用石英玻璃和光学玻璃、PET 片的色素降解速率较为接近。棕色玻璃在可见光区透过率较低，在波长350 nm 处透过率接近零，仅在波长350～400 nm 的近紫外区有少量透过，对紫外光具有良好的屏蔽作用，降解反应速率最低，为0.0096 h-1，半衰期达到72.2 h。对色素产品应选择紫外光阻隔性能较好的包装材料、被膜，避光贮存，有助于减缓色素光降解褪色的速度。

2.5 桑葚色素氧化稳定性

20℃，距液面30 cm 设置日光模拟灯，用过氧化氢标准溶液调节色素溶液中过氧化氢浓度分别为2.5，5.0，10.0 mmol/L，吸光度变化如图8所示，一级动力学拟合见图8插图、表。相较光照，桑葚色素对过氧化氢表现出极不耐受，反应速率常数呈现数量级式增加，随着氧化剂浓度提高，色素剧烈降解。空气中氧气、溶解氧在一定条件下产生羟基、过氧自由基等活性氧化物，攻击桑葚花色苷分子，破坏其分子结构，发生褪色。光照会催化该过程，增加自由基产生，加速降解[18]。

图8 桑葚色素氧化稳定性Fig.8 Oxidative stability of mulberry pigments

日光模拟灯光照的无过氧化氢添加体系中加入还原剂VC，桑葚色素降解及其一级动力学拟合如图9所示。VC 可以还原反应体系少量氧化剂，捕获氧化性自由基，添加适量VC 对色素降解表现出抑制作用。

图9 不同浓度VC 对色素降解的影响Fig.9 Effects of concentrations of VC on the degradation

3 结论

本文设计开发了一种基于在线光度法的动力学数据采集装置和方法。装置集成度高，方便施加多条件控制，测定准确、稳定，可实现无人值守自动采集数据，大幅降低了测试工作劳动强度，提高了测试效率，可广泛应用到各类天然色素稳定性研究中。利用该装置测定了酸碱、热、光、氧化降解及包装材料、还原剂保护对桑葚色素稳定性的影响，发现桑葚色素在pH 值为3 的酸性环境中呈现鲜艳红色、色价高，高温、紫外光和氧化剂会加速降解，并获得了各条件下准确的降解速率常数和热解表观活化能（60.2 kJ/mol）。冷藏、紫外线阻隔及适量还原剂VC 能有效减缓降解速度，有利于延长色素及相关产品贮存时间及货架期。