姜黄素对人胃癌SGC7901细胞的抑制作用及其作用机制探讨

包亚芳 陈定伟 王鸿

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球恶性肿瘤中排名第5 位，致死率位居第3 位[1]；目前临床上胃癌的综合治疗方法主要以手术为主，并辅助化疗和免疫治疗等。临床上常规的化疗药物毒性大且比较容易产生耐药性，因此目前国内外的研究热点是寻找有效及毒副作用小的天然抗癌药物。姜黄素是近年来备受关注的天然活性药物，是从姜科植物姜黄的根茎中提取的主要有效成分，有研究表明姜黄素能够诱导肿瘤细胞的凋亡，具有逆转肿瘤耐药性和增强化疗药物敏感性的作用[2,3]，已成为国际天然抗癌药物研究领域的一个新热点。但是目前姜黄素的抗癌机制还不够明确，本次实验通过研究姜黄素对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，来初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 本次研究在浙江大学医学院附属邵逸夫医院进行，时间为2012 年1 月至2019 年12 月。人胃腺癌细胞株SGC7901 购自中科院上海细胞研究所。人胃腺癌细胞株SGC7901 用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养基培养，放置在37 ℃、5%CO2的培养箱中。姜黄素（C21H20O6=368.9，纯度≥98%）由Sigma 公司生产，MTT 检测试剂盒由江苏碧云天生物技术研究所生产，半胱氨酰天冬氨酸酶-3（caspase-3）一抗、蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）一抗、β-Actin 一抗、信号转导与转录激活子（signal transducers and activators of transcription，STAT）1 一抗和STAT3 一抗均由Cell Signaling Technology 公司生产，PCR试剂盒由TaKaRa公司生产。

1.2 MTT 比色法检测细胞增殖 取对数生长期的人胃癌SGC7901 细胞，用培养液调节细胞悬液中细胞的密度为5.0×105/ml，接种于96 孔细胞培养板，每孔加入100 μl 细胞悬液，于培养箱中培养24 h。同时将姜黄素溶解于DMSO（由Sigma 公司生产），用含10%的胎牛血清的RPMI1640 稀释，终浓度为0 μmol/ml、10 μmol/ml、20 μmol/ml、40 μmol/ml 和80 μmol/ml。用上述不同浓度的姜黄素处理胃癌SGC7901 细胞，每一浓度设5 个平行孔，培养24 h、48 h后，每孔加入新鲜配置的MTT 20 μl（5 mg/ml），继续培养4 h，弃去上清液，每孔加入DMSO 200 μl，振荡均匀，采用酶标仪在570 nm 波长读取吸光度值（A），以不含姜黄素的DMSO 为阴性对照组，并按照公式计算抑制率：

抑制率=[1-A（药物干预组）/A（空白组）]×100%。

1.3 细胞凋亡率的检测 采用Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒（由南京凯基生物科技发展有限公司生产）检测细胞凋亡，取对数生长期的细胞接种于6孔细胞培养板中，培养24 h。选用20 μmol/ml的姜黄素处理细胞，继续培养24 h、48 h 后，把细胞培养液吸出至合适离心管内，用胰酶消化收集细胞，1 500 r/min 离心5 min，弃上清，收集细胞，用磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞并计数。取1×105～5×105细胞悬液，1 500 r/min 离心5 min 后弃去上清液，加入500 μl 的1×Binding Buffer，加入5 μl Annexin V-FITC，再加入10 μl 碘化丙啶，轻轻混匀。室温（20 ℃～25 ℃）铝箔避光孵育5～15 min，1 h 内进行流式细胞仪检测，设定激发波长为488 nm，发射波长为530 nm，Annexin V-FITC 的绿色荧光FITC通道为FL1；碘化丙啶的红色荧光通过碘化丙啶通道为FL2，以未经姜黄素处理的SGC7901 细胞作为阴性对照组。

1.4 Western blot 法测定caspase-3 和PERK 蛋白的表达 取对数生长期人胃癌SGC7901细胞，分组后用浓度为20 μmol/ml 姜黄素处理细胞，孵育24 h、48 h 后，收集细胞提取蛋白并测定蛋白浓度。将准备好的样品进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，在5%脱脂奶粉溶液中室温孵育1 h，然后加入一抗室温孵育1.5 h 后，用TBST 冼5 min×5 次，然后用近红外染料标记的二抗（由Li-COR 公司生产）室温孵育1.5 h，再用TBST 洗5 min×5 次，将膜在近红外双色激光成像系统上扫描蛋白条带，采用Bio-Rad 凝胶图像处理系统。

1.5 逆转录聚合酶链式反应技术检测姜黄素处理的人胃癌SGC7901 细胞中的STAT1 mRNA 及STAT3 mRNA 的表达 取对数生长期人胃癌SGC7901 细胞，分组后用浓度为20 μmol/ml 姜黄素处理细胞，孵育24 h、48 h 后，收集细胞采用Trizol试剂盒（由Promega 公司生产）提取总RNA 后，用Nanodrop 仪器测定其RNA 浓度，然后按照试剂盒的要求进行逆转录反应，并进行定量PCR 检测。每组实验重复3 次。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用F检验和t检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素抑制人胃癌SGC7901细胞增殖见图1

图1 不同浓度姜黄素对人胃癌SGC7901细胞增殖的抑制作用

由图1 可见，姜黄素作用24 h、48 h 后，与姜黄素浓度为0 μmol/ml 比较，10 μmol/ml、20 μmol/ml、40 μmol/ml 和80 μmol/ml 姜黄素作用后细胞生长明显受抑制，差异均有统计学意义（t分别=2.46、2.75、8.45、7.98；2.57、6.61、8.49、8.33，P均＜0.05）。同时姜黄素浓度越高，细胞生长受抑制越多，差异均有统计学意义（F分别=33.90、42.75，P均＜0.05）。姜黄素对人胃癌SGC7901 细胞24 h、48 h 的半数抑制率（IC50）分别为35.41 μmol/ml和16.56 μmol/ml。

2.2 20 μmol/ml 姜黄素对人胃癌SGC7901 细胞凋亡的影响见图4

由图4 可见，人胃癌SGC7901 细胞经过浓度为20 μmol/ml 姜黄素处理24 h 和48 h 后，凋亡率分别为47.48%和27.68%，与未经处理的细胞的凋亡率10.51%比较，凋亡率明显增大，差异均有统计学意义（t分别=14.58、6.27，P均＜0.05）。

图4 20 μmol/ml姜黄素对人胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

2.3 20 μmol/ml 姜黄素对人胃癌SGC7901 细胞中caspase-3、PERK蛋白表达的影响见图2

图2 20 μmol/ml姜黄素对人胃癌SGC7901细胞caspase-3和PERK蛋白表达的影响

由图2 可见，20 μmol/ml 姜黄素处理人胃癌SGC7901 细胞24 h 后，cospase-3 和PERK 蛋白表达变化不大（t分别=2.27、2.06，P均＞0.05），48 h 后的姜黄素组caspase-3 和PERK 蛋白的表达均明显高于阴性对照组，差异均有统计学意义（t分别=23.32、17.79，P均＜0.05）。

2.4 20 μmol/ml 姜黄素对人胃癌SGC7901 细胞中STAT1及STAT3 mRNA表达的影响见图3

图3 20 μmol/ml姜黄素对人胃癌SGC7901细胞中的STAT1 mRNA、STAT3 mRNA表达的影响

由图3 可见，与阴性对照组比较，20 μmol/ml 姜黄素作用24 h、48 h 后的人胃癌SGC7901 细胞中的STAT1 mRNA 含量明显升高，而STAT3 mRNA 的含量明显下降，差异均有统计学意义（t分别=5.22、20.55；5.15、12.48，P均＜0.05）。

3 讨论

姜黄素是一种植物多酚，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和降血脂等作用，已成国际植物药研究的一个新热点。目前已有大量的文献证明其对乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤具有抑制和诱导凋亡作用[4,5]。文献报道姜黄素对人胃癌SGC7901 细胞的抑制作用有浓度依赖性[6]。本次实验中MTT 的结果也证实了姜黄素对人胃癌SGC7901 细胞的抑制作用具有浓度和时间依赖性。细胞凋亡实验发现姜黄素能够诱导人胃癌SGC7901 细胞的凋亡，起抗肿瘤作用。本次实验结果表明姜黄素处理人胃癌SGC7901 细胞24 h 后，凋亡率达到47.48%，可使肿瘤细胞的比例下降将近一半的量，而在处理48 h 后，凋亡率为27.68%，肿瘤细胞的比例下降反而不如24 h，可能是由于在孵育24 h 后存活的肿瘤细胞已经产生有一定的耐药性，这需要后续的进一步研究；也有可能是由于实验所选的细胞均为贴壁细胞，已凋亡的细胞已经漂浮在细胞液中，在后处理过程中，弃去细胞液的过程中误将凋亡细胞一起丢弃，从而造成结果出现偏差，这需要在后续的实验中进行改进。

胃癌的发生是一个复杂的过程，是多基因作用、多种细胞信号传导调控异常的结果[7]。姜黄素的抑癌机制主要包括抑制肿瘤细胞的增殖、肿瘤细胞迁移等[8]，并且可以和化疗药物合用，起到协同作用，降低化疗药物的剂量和逆转耐药性[9]。caspase与细胞凋亡密切相关，目前认为其是一切细胞凋亡信号传导的共同通路，人体内共有14 种caspases，起核心作用的是caspase-3，在细胞中以无活性的酶原形式存在。当细胞凋亡信号传导到酶原后，部分酶链水解形成具有活性的caspase-3，然后激活一系列的caspases，最后导致细胞凋亡的发生[10]。PERK 是哺乳动物细胞内质网上的三个跨膜感应蛋白之一，PERK 可以通过持续激活内质网应激而诱导细胞凋亡，是诱导细胞凋亡的重要途径[11]。本次实验结果表明经过20 μmol/ml 姜黄素处理人胃癌SGC-7901 细胞24 h 后，caspase-3 蛋白和PERK蛋白的表达不大，而48 h 后两者的表达量均急剧增大（P均＜0.05），这说明姜黄素在给药一定时间后，能够激活人胃癌SGC7901 细胞中caspase-3 蛋白和PERK 蛋白的表达，从而使肿瘤细胞进入凋亡途径，产生抗肿瘤作用。

STAT是重要的细胞内信号转导分子，可将细胞外信号传送至细胞核，研究发现在胃癌组织中发现其成员的过度表达，尤其是STAT3 的表达明显高于正常胃组织中的表达，激活的STAT 对肿瘤细胞的生长、增殖、凋亡等过程有重要的调控作用。本次实验发现姜黄素能够使人胃癌SGC7901 细胞中的STAT3 mRNA的表达量明显下降（P＜0.05）。STAT3控制了肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白介素（interleukin，IL）-1β 等的产生，STAT3 mRNA 表达的抑制，引起了白细胞聚集的下降，从而使TNF-α、IL-1β 的产生，从而抑制胃癌细胞的增殖。目前已有文献研究表明，肿瘤组织中STAT3 表达的升高提示肿瘤的进展和较差的预后[12]。不同于STAT3，STAT1 可抑制抗凋亡蛋白Bcl2 和Bcl-X 基因的表达，从而促进细胞凋亡。有文献报道在胰腺癌等恶性肿瘤中，STAT1 表达的升高提示良好的预后[13]。本次实验结果显示在姜黄素处理人胃癌SGC7901 细胞后，细胞中的STAT1 mRNA 的表达明显升高（P＜0.05）。因此姜黄素抗肿瘤机制很可能一方面通过上调STAT1 表达来促进胃癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长；另一方面，姜黄素又能下调STAT3 表达来起到抑制胃癌细胞增殖的作用。

综上所述，姜黄素能够抑制人胃癌SGC7901 细胞的增殖，促进细胞凋亡，其抗肿瘤作用机制可能与激活caspase-3、PERK、STAT1 和抑制STAT3 等有关。作为研究新热点的姜黄素可望作为治疗胃癌的中医药原创药物之一，但是其作用机制、在体作用及临床应用前景还有待进一步的实验和研究。