缺氧在小鼠肺间质肌成纤维细胞化过程中的作用及黄芩苷的保护机制

颜双泉 陈璐 黄晶 林玲 陈马云 吕冬青

肺间质纤维化是一种严重的、进行性加重的肺部慢性疾病。肺间质纤维化目前仍然是临床治疗的难点，在肺间质纤维化进程早期进行干预可能是控制肺间质纤维化的有效办法之一。缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible transcription factor-1，HIF-1）目前被认为可能和肺间质纤维化相关。本次研究通过让小鼠长期处于缺氧状态，探索缺氧对小鼠肺间质的影响和可能机制，并且通过黄芩苷的干预来评估其保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 本次研究起止时间为2019 年6 月至2020 年7 月，实验采用6 周龄C57BL/6 清洁级别小鼠作为实验小鼠，小鼠购自温州医科大学动物实验中心，动物实验通过恩泽医疗中心伦理审批。

1.2 方法

1.2.1 低氧小鼠模型制备和标本初步处理 小鼠共30只，每组10只，随机分为三组：常氧组、低氧组、低氧+黄芩苷组。低氧组放入11% 氧浓度低氧氧舱内，每天8 h，放置6 d 后在常氧下放置1 d，共放置4 周；低氧+黄芩苷组在放入低氧氧舱前，按30 mg/kg黄芩苷的剂量，计算所需已配比好的浓度为1 mg/ml的黄芩苷的容量，注入小鼠腹腔内，其余步骤同低氧组。4 周后，用10%水合氯醛麻醉三组小鼠，取左肺叶放入4%多聚甲醛固定后用石蜡包埋并切片。取右肺叶放置-80 ℃冰箱以备组织匀浆。

1.2.1 免疫组化技术检测三组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达情况：常规脱蜡、水化、柠檬酸盐缓冲液修复，3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，然后孵育稀释后的一抗，三种一抗稀释比例分别为：小鼠单克隆胶原蛋白抗体Ⅰ（1∶500），小鼠单克隆胶原蛋白Ⅲ抗体（1∶500），小鼠单克隆α-SMA 抗体（1∶1000），阴性对照组孵育10%山羊血清。一抗孵育完成后磷酸盐缓冲液进行冲洗，将辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠抗体对应孵育，磷酸盐缓冲液冲洗后用二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色。

1.2.2 Western blot 法检测肺组织α-SMA 含量 取小鼠新鲜左肺，放在冰浴盆中用玻璃研磨器中研磨至匀浆状态，加入裂解液，然后在3 000 r/min、4 ℃条件下离心15 min。用二辛可酸法对上清液中蛋白浓度进行检测，并用磷酸盐缓冲液调整蛋白浓度，加上样缓冲液稀释至2 μg/ul，标本100 ℃加热5 min变性待用，每次取含20 μg蛋白量标本进行电泳跑胶、转膜、4 ℃冰箱中，用1∶2000 小鼠单克隆α-SMA 抗体过夜孵育转膜后PVDF，冲洗后二抗孵育后显色、曝光。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示。计量资料比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA表达情况见图1～3

图1 三组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ表达情况比较（免疫组化法染色，×400倍）

图2 三组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅲ表达情况比较（免疫组化法染色，×400倍）

图3 三组小鼠肺间质α-SM actin表达情况比较（免疫组化法染色，×400倍）

由封二图1～3 可见，常氧组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 仅轻度表达；低氧组小鼠肺间质肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 的表达均明显增高；低氧+黄芩苷组小鼠肺间质肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 的表达则较单纯低氧组明显下降。

2.2 三组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA表达量比较见表1

表1 三组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA表达情况

由表1 可见，三组间肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 表达比较，差异均有统计学意义（F分别=75.04、15.10、29.71，P均＜0.05）。组间两两比较发现，低氧组肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 表达均明显高于常氧组（t分别=11.74、4.69、7.67，P均＜0.05）；低氧+黄芪苷组胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 表达明显低于低氧组，差异均有统计学意义（t分别=5.12、3.02、4.51，P均＜0.05）。

2.3 三组小鼠肺组织α-SMA表达情况见表2

表2 三组小鼠肺组织α-SMA表达情况

由表2 可见，三组肺组织α-SMA 表达比较，差异有统计学意义（F=264.48，P＜0.05），组间两两比较发现，低氧组肺组织α-SMA 表达明显高于常氧组，低氧+黄芪苷组α-SMA 表达明显低于低氧组，差异均有统计学意义（t分别=22.04、13.40，P均＜0.05）。

3 讨论

机体缺氧能够导致肺间质的急性损伤，长期缺氧导致了肺间质持续的损伤，持续损伤促进了肺间质的异常修复和重构，并进入到肺间质纤维化进程中。HIF-1 在肺间质的纤维化作用中起着非常关键的始动作用[1]。在缺氧状态下，转化生长因子-β1能够被HIF-1 上调，成为肺间质纤维化过程中的重要调控因子。转化生长因子-β1 调控肺间质纤维化主要通过成纤维细胞向肌成纤维细胞转化、内皮细胞间充质转换、上皮细胞间充质转换这三种机制实现[2～5]。肌成纤维细胞具有非常复杂的来源，在病理状态下，肌成纤维细胞能够产生大量的细胞外基质，比如大量的胶原蛋白及明胶物质，尤其是胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ的堆积，导致细胞外基质成分比例失调，促进了结缔组织的重构及组织纤维化的进程，α-SMA是肌成纤维细胞的特征性标记物[6]。

黄芩苷是黄芩中纯化的黄酮类单体，已被证明具有抗肿瘤、抗炎、抗纤维化的作用[7，8]。有研究报道，黄芩苷能够通过减少肝脏胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ的生成，来抑制肝纤维化作用[9]。本次研究结果显示，低氧组小鼠肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ及α-SMA 较常氧组明显升高（P均＜0.05）。同时，采用Western blot 技术检测肺组织α-SMA表达情况，结果显示低氧组较常氧组亦明显升高（P＜0.05）。低氧+黄芩苷组小鼠的肺间质胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 以及肺组织α-SMA 表达量均明显低于低氧组（P均＜0.05）。提示缺氧促进了肺间质肌成纤维细胞细胞化进程，低氧组加入黄芩苷干预后减缓了小鼠肺间质这些指标的上调，提示黄芩苷具有保护性作用。

由于HIF-1在常氧环境下极不稳定以及试验条件所限，本次实验作为动物在体试验，未能直接阐述HIF-1和肺间质肌成纤维化进程中相关信号通路的关系。通过加入HIF-1高选择性抑制剂甚至是引入HIF-1 基因敲除小鼠，联合缺氧在肺间质肌成纤维细胞株层面的机制研究，可能是今后进一步的研究方向。

综上所述，缺氧导致肺间质肌成纤维细胞化进程相关的胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、α-SMA 指标明显上调，提示缺氧参与这一进程。黄芩苷干预后这些指标明显下调，提示具有保护性作用。