养殖花鲈（Lateolabrax maculatus）肠道菌群的多样性分析

林能锋，潘滢，许斌福，龚晖，曾红

（1.大黄鱼育种国家重点实验室，宁德富发水产有限公司，福建 宁德 352100；2.福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003；3.福建师范大学生命科学学院南方海洋研究院，福建 福州 350007）

鱼类肠道微生物群落与其食物消化、营养代谢、发育及机体免疫等重要的生理特征密切相关[1-5]。鱼类肠道细菌的多样性受宿主遗传发育、食性及水环境等多种内外因素的影响[6]。更好地了解肠道菌群与鱼类健康之间的相互作用是水产养殖可持续发展的关键之一。

花鲈（Lateolabrax maculatus）隶属于鲈形目（Perciformes），花鲈属（Lateolabrax），分布于中国沿海、日本及朝鲜[7]，2019年我国养殖产量180 173 t[8]，是沿海地区重要的海水养殖鱼类种类。研究表明，在正常生理状况下，花鲈肠道菌群主要以变形菌门、厚壁菌门、放线菌门及拟杆菌门细菌为主要类群[9-12]。张琛等[10]对浙江舟山网箱养殖花鲈研究发现，其肠道菌群中厚壁菌门细菌占比高达71.6%，而在另外一些学者的研究中，变形菌门细菌则是花鲈肠道菌群中的优势类群[9，11-12]。Clements等[13]认为对鱼类肠道微生物群落功能的研究必须将宿主所处的生态环境和宿主鱼类生理状况相联系。在上述花鲈肠道菌群的研究中，花鲈的养殖环境（地域、水温）和投喂饵料种类存在较大差异，从而反映出其肠道菌群的结构也有着明显的不同。因此，有必要对不同养殖条件下花鲈肠道菌群的多样性进行研究，以期对花鲈肠道菌群在不同环境及养殖方式的适应性变化方面有更深入的了解。

在正常肠道微生态平衡的条件下，有益微生物菌群定植于肠黏膜，形成非特异性的菌膜屏障，抑制病原菌在肠壁内定植[14-16]。同时，肠道微生物与宿主在肠道黏膜表面的交流促进了免疫系统的建立和发展，成为重要的免疫屏障[17]。因此，鱼类肠壁定植菌的研究可对鱼类的健康及病害防治提供重要参考。潘艳艳等[9]探讨了饥饿状态对花鲈肠壁菌群的影响，但由于技术条件的制约，对正常养殖状态下肠壁定植菌的复杂性的分析还显不足。

现分析了福建宁德三都澳海水网箱养殖花鲈肠道内容物及肠壁菌群的多样性特征,目的是揭示近岸网箱养殖条件下花鲈肠道细菌多样性,并与相关研究进行比较，以充实花鲈肠道菌群的研究数据，为花鲈的病害防治及开发功能性饲料添加剂提供更多的科学依据。

1 研究方法

1.1 实验样品

花鲈（L.maculatus）商品成鱼采自福建宁德三都澳大湾村养殖网箱。采样时间为2017年9月，养殖海区表层水温25℃，海水pH值为8.0，盐度26.8。投喂冰鲜杂鱼糜。养殖花鲈摄食正常，采样前一个月内未发现明显的病害，亦未投喂药物。共采样9尾鱼，平均体质量（244±12）g，随机分为3个平行组，每组3尾。

活鱼用MS222麻醉，鱼体表面用70%酒精进行体表消毒，在超净工作台内以无菌解剖剪剪取采样鱼的中、后肠，以无菌眼科镊轻轻挤出肠道内容物，每组3尾鱼的肠道内容物混匀成一个肠道内容物样品。

无菌注射器吸取无菌生理盐水冲洗上述肠道样品的内壁，直到无肉眼可见肠道内容物洗出，将肠道剪碎混匀，3尾鱼的肠道组成一个鱼肠壁样品。上述样品采样后均快速放入液氮中运回实验室，并保存于-80℃备用。

1.2 PCR扩增及16SrDNA高通量测序

肠道微生物样本DNA用E.Z.N.A.stool DNA试剂盒（Omega Biotek,Norcross,GA,U.S.）提取。提取得到的DNA样品用1%琼脂糖凝胶电泳检测和分光光度法（260 nm/280 nm）进行质量检测。检测合格后，将样品于-20℃保存备用。16SrRNA基因V3-V4区的扩增引物序列为341F：CCTACGGGNG GCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT，引物具有8碱基的特异性barcode以区别不同样品。PCR反应条件为：预解链95℃2 min；98℃解链10 s，62℃退火30 s，68℃延伸30 s，共进行27个循环；68℃延伸10 min。PCR反应体系为：5μL 10×KOD缓冲液，5μL 2.5 mmol/L dNTPs，引物（5μmol/L）各1.5μL，1μL KOD DNA聚合酶，模板DNA100 ng，反应总体积50μL。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。扩增后样品委托广州基迪奥生物科技有限公司于Illumina Hiseq 2500平台（PE250）测序。

1.3 数据分析

根据引物上barcode序列从下机数据中拆分出各样品测序数据，利用FLASH Version 1.2.11及Qiime Version1.9.1软件对数据进行过滤、拼接，并利用数据库（Gold database）比对（UCHIME Algorithm）检测并去除嵌合体序列，利用Mothur软件包对tag序列进行了去冗余处理，从中挑选出unique tag序列。用Uparse软件（Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/）对所有样品的全部Effective Tags序列聚类，以97%的一致性（Identity）将序列聚类成为可操作分类单元OTUs，计算出每个OTU在各个样品中的Tags绝对丰度和相对信息。样品均一化值（cutoff=20 351），以处理后的数据为基础进行多样性分析。物种的注释基于SILVA数据库的RDP classifier。

2 结果与分析

2.1 基于16SrDNA测序的花鲈肠道菌群多样性

对测序的原始数据去冗余处理及有效标签序列聚类后，鲈鱼肠道内容物及肠壁样品分别得到OTU数为456个和293个，见表1。选取2分组中平均丰度>1的所有OTU（即高丰度并集OTU）绘制韦恩图，见图1。2组样品共有OTU数目192个。

表1 花鲈肠道菌群样品16 SrDNA测序数据

图1 韦恩图显示花鲈肠道内容物及肠壁样品中OTU数目

对6个花鲈肠道内容物及肠壁测序样品的测序量和测序深度进行评估，其Good’s coverage指数0.999±0.001，shannon稀释曲线达到平台期，说明测序量已基本覆盖样品中所有的物种。对花鲈肠道内容物和肠壁菌群的α-多样性分析结果见表2。从物种丰富度指数来看，花鲈肠道内容物的物种丰富度高于肠壁。但从综合体现物种的丰富度和均匀度的Simpson/Shannon指数来看，肠壁菌群略高于肠道内容物。但α-多样性指数的t检验显示，两者间的差异并不具统计学意义（P>0.05）。花鲈肠道2个分组的菌群β-多样性差异分析显示，两个分组间物种多样性存在一定差异，但组间的差异并不具统计学意义（t检验，P>0.05），见图2。

2.2 花鲈肠道菌群的物种分类及差异分析

对OTU进行分类注释的结果表明，中国花鲈肠道菌归属于22个门120个属。其中厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门、拟杆菌门和放线菌门是最主要的类别，其他门类的细菌数量在总肠道菌中的数量占比均<1%，见表3。上述4个门类的细菌分别占肠道内容物样品和肠道壁细菌总量的98.98%和96.40%。厚壁菌门在肠道内容物与肠壁样品菌群中丰度最高，但肠道内容物与肠壁样品中变形菌门和梭杆菌门细菌的丰度则有较大的差异。其中梭杆菌门细菌在肠壁菌群中的占比（2.72%）远小于肠道内容物（17.79%）。

表2 网箱养殖花鲈肠道菌群的α-多样性指数

对花鲈肠道菌群属的结构组成变化分析表明，肠道内容物中，发光杆菌属（Photobacterium）（15.5%）、鲸杆菌属（Cetobacterium）（17.75%）和梭菌属（Clostrid－ium）（12.45%）3个属的细菌占比最高，而在肠壁菌群中，除上述3属外，乳球菌属（Lactococcus）、真杆菌 属（Eubacterium）、Lachnoclostridium、Arcobacter、Flavonifractor也是主要的属一级类群。

表3 中华花鲈肠道优势细菌门类及相对丰度 %

图3 花鲈肠道菌群相对丰度>1%菌属LEfSe分析

花鲈肠道内容物和肠壁菌群物种差异的LEFse分析见图3。在花鲈肠壁差异标志性菌群中厚壁菌门的链球菌属（Sreptococcaceae）、乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus），变形菌门的不动杆菌属（Acinetobacter）、甲基杆菌属（Methylobacterium）等为其主要类群。而在花鲈的肠道内容物中则以梭杆菌门的鲸杆菌属（Cetobacterium）、厚壁菌门的梭菌属（Clostrdium）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）和漫游球菌属（Vagococcus）细菌为其主要的差异标志性菌群。

3 讨论

对有关花鲈肠道菌群的几项研究[9-11]进行对比发现，尽管存在不同菌群的丰度差异，花鲈肠道菌群中还是以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门为主要优势菌。由于潘艳艳等[9]研究采用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术，故其所得到的菌群的类型较少。文献［11-12］的分析表明，在室内养殖较小水体以花鲈幼鱼为实验对象且投喂人工配合饵料，得到变形菌门细菌在花鲈肠道菌群中的占比最高，其次为厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。该研究结果与张琛等[10]的研究相似，花鲈均为沿海网箱养殖，投喂冰鲜鱼糜，结果均得到花鲈肠道菌群中以厚壁菌门为最大的优势菌门类。文献［18-20］研究表明，水体养殖环境与投喂饵料类型对鱼类肠道菌群的形成和保持有重大的影响，因而推测养殖环境和饵料差异可能是造成不同研究间肠道菌群结构差异的主要原因。

在生态学上，核心物种间的互利共生是保持生态系统多样性和群落稳定的重要因素[21-23]。已有不少研究证明了鱼类肠道中存在核心微生物菌群[24-27]，肠道部分的生境过滤是形成鱼类肠道微生物群落的主要驱动因素。将该研究与张琛等[10]的研究比较发现，花鲈肠道菌群属级分类单元中梭菌属（Clostridium）、发光杆菌属（Photobacterium）及乳球菌属（Lactococcus）等属是共有的优势菌属，推测在网箱养殖花鲈肠道菌群中存在一个以上述菌属为主要代表的具有宿主特征的核心微生物群落，但对鱼类肠道核心菌群的功能及其相互作用还知之甚少，还有待深入研究。

在对鱼类肠道菌群的研究中发现，肠壁黏液中细菌种群的丰度和多样性与肠道内容物中的微生物群落构成不同，一些微生物种类在肠壁黏膜层的定植性较差[14，28-29]。胡俊[30]对斑马鱼肠道黏膜定植菌的研究发现，鲸杆菌属细菌具有较好的鱼类肠黏膜定植能力，是鱼类微生物屏障功能的重要组成部分。但本研究中对花鲈肠道内容物与肠壁菌群进行差异分析，鲸杆菌属则在肠道内容物中占比较高，而在肠壁黏膜上定植量较少，其原因尚需进一步考察。

在该研究中发现肠壁菌群中有多种细菌类别，如L.garvieae[31-32]、P.damselae[33-34]都是鱼类的条件致病菌，验证了许多病原体是鱼类消化道菌群的组成部分的观点[14，35]。在正常情况下，这些菌在肠道内的定植对刺激宿主的免疫系统，提高对病原体的免疫力有重要作用[17]，但集约化养殖过程中因养殖环境恶化及饲养管理不当等原因，病原菌过度生长和广泛传播而导致病害的爆发[14]。总之，鉴于鱼类消化道微生物区系的复杂性，还需要从鱼类肠道菌群与宿主、环境互作等多个领域展开深入的研究。