维生素C对克氏原螯虾生长及非特异性免疫机能的影响

田立立，万金娟，孟祥龙，周梓涵，孙龙生*，唐建清

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

“十三五”以来，小龙虾（学名克氏原螯虾，Procambarus clarkii）产业呈现爆发式增长，2019年我国小龙虾养殖规模达128.66万hm2，总产量达208.96万t，总产值突破4 000亿元大关[1]。其中稻虾综合种养占86%，已经成为小龙虾生态健康养殖的主流模式。在实际生产过程中，小龙虾养殖密度大，水体残饵粪便累积较多，水质难以控制，尤其是小龙虾池塘水草丰富，水体昼夜pH值变化大，再加上不稳定的气候条件以及相互蚕食的习性等因素，小龙虾机体长期处于应激状态，导致疾病频发，生长缓慢，甚至出现大规模死亡现象，严重制约产业的可持续发展[2]。通过营养调控来促进克氏原螯虾生长，提高抗病力、免疫力已成为研究热点。文献［3］研究表明，维生素C（Vc）具有促进克氏原螯虾幼虾生长，提升机体免疫力和成活率的作用。Fuertes等[4]认为，饲料中不同Vc水平（0、0.2、0.4和0.8 g/kg）对克氏原螯虾存活率没有显著影响，但0.2 g/kg组的克氏原螯虾机体生长最为显著，且饵料系数明显降低。有关克氏原螯虾对Vc的适宜需要量以及Vc影响虾的成活与生长的生理机制尚未清楚。该试验旨在探讨饲料中添加不同水平Vc对克氏原螯虾幼虾生长及免疫机能的影响，为进一步明确克氏原螯虾对Vc的适宜需要量提供依据。

1 研究方法

1.1 试验设计

采用单因子试验设计，选择规格基本一致、活力好、附肢健全、初始体质量为（3.19±0.06）g的克氏原螯虾幼虾540尾，随机分为6组，每组3个重复，放入18个循环流水水泥池中养殖（2 m×2 m×0.8 m），每个水泥池放养30尾，同时配套遮阳与隐蔽设施。

1.2 试验饲料

以鱼粉、豆粕为蛋白源，豆油为脂肪源，并补充矿物质、维生素等，在此基础上添加不同水平的维生素C，配制6组等氮等能饲料，见表1。饲料中维生素C（95%包膜维生素C，罗氏公司）的添加量为：0、30、60、120、240和480 mg/kg。试验饲料委托安徽新希望饲料有限公司加工制作，每组饲料2 t/批次，选取中间部分的饲料，50℃烘干后置于-20℃冰柜中保存备用。

表1 基础饲料配方及营养水平①（风干基础）

1.3 饲养管理

克氏原螯虾幼虾在水泥池暂养14 d后正式开始投喂试验饲料，每天投喂2次（07：30—08：30和18：30—19：30）。初始日投饵量为虾体质量的3%，后期根据摄食和生长情况适当调整，以投饵后1 h内吃完为宜。饲养期间水温21.9～27.5℃，pH值7.8～8.5，ρ（溶解氧）>6 mg/L，ρ（氨氮）<0.04 mg/L，ρ（硫化氢）<0.01 mg/L，ρ（亚硝酸盐）<0.01 mg/L，试验期间07：30—18：30打开遮阳网，每日观察虾摄食及死亡情况，发现死虾及时捞出并称重计数，分析死亡原因。试验期60 d。

1.4 样品采集

养殖试验结束后，禁食24 h，对各水泥池的克氏原螯虾分别进行计数和称重，以计算存活率和增重率。冰浴麻醉后进行虾体的解剖，每个水泥池随机选取3尾虾（每组9尾虾），先抽血淋巴，然后采集肌肉、肝胰腺并称重。另随机采集3尾虾的肝胰腺，液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用，待测定免疫相关指标。

1.5 指标测定

（1）生长指标。分别按下式计算增重率（WGR）、成活率（SR）、肥满度（CF）、含肉率（MF）、肝胰腺指数（HSI）、饲料系数（FCR）、特定生长率（SGR）等指标。

增重率（%）=（M1×M0）/M0×100%

成活率（%）=N1/N0×100%

饲料系数=Mf（/M1×M0）

特定生长率（%/d）=（ln M1×ln M0）（/T1-T0）×100%

含肉率（%）=Mj/M1×100%

肥满度=M1/Lt3×100%

肝胰腺指数=Mg/M1×100%

式中：M1，M0——分别为终末平均质量、初始平均质量，g；

Mf——饲料摄入量，g；

Mj、Mg——分别为肌肉重、肝胰腺重，g；

N1、N0——分别为终末尾数、初始尾数，尾；

L1——终末均体长，cm；

T1、T0——试验开始时间、结束时间，d。

（2）血液免疫指标。用1 mL无菌注射器（含抗凝剂）从螯虾头胸甲腹侧取血淋巴，注入无菌1.5 mL离心管中，使血液与抗凝剂最终比例为1∶1，低温离心（4℃，3 000 r/min）10 min（分离血浆和血细胞），取上清液，-20℃保存备用，用于血液免疫指标（溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶）的测定。

（3）肝胰腺抗氧化相关指标。将采集的肝胰腺用生理盐水冲洗干净，然后按1∶9质量体积比加入生理盐水，冰浴匀浆，以3 500 r/min离心10 min，取上清液置于新的离心管待测。所有上清液先用考马斯亮蓝法检测其蛋白浓度后再测其他抗氧化指标。肝胰腺超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.6 统计分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0对试验数据进行统计学分析（One Way ANOVA），多重比较采用Duncan法，试验数据以平均值±标准差（Mean±Std）表示，统计学意义水平设定为P<0.05，表中同行数据肩标字母不同，表示组间差异具统计学意义（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 饲料中维生素C添加水平对克氏原螯虾生长的影响

维生素C添加水平对克氏原螯虾生长的影响见表2。由表2可见，120 mg/kg Vc试验组虾的增重率和特定生长率显著高于其他各组（P<0.05）；480 mg/kg Vc组虾的含肉率显著高于其他各组（P<0.05）；各组间克氏原螯虾其余生长指标未出现统计学意义差异（P<0.05）。

表2 维生素C添加水平对克氏原螯虾生长的影响

2.2 饲料中维生素C添加水平对克氏原螯虾血液免疫相关指标的影响

维生素C添加水平对克氏原螯虾血液免疫指标的影响见表3。由表3可见，120 mg/kg Vc试验组血清溶菌酶显著高于其他各组（P<0.05），而其他试验组间则没有统计学意义差异（P>0.05）；120和480 mg/kg Vc试验组血清酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性没有统计学意义差异（P>0.05），却显著高于其他4组（P<0.05）。

表3 维生素C添加水平对克氏原螯虾血液免疫指标的影响

2.3 维生素C添加水平对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响

维生素C添加水平对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响见表4。由表4可见，120 mg/kg Vc组虾的肝胰腺过氧化氢酶活性显著高于其他各组（P<0.05），其他试验组间则没有统计学意义差异（P>0.05）；饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺超氧化物歧化酶活性没有显著影响（P>0.05）；饲料中未添加维生素C组肝胰腺MDA含量显著高于各添加组（P<0.05）；120 mg/kg Vc试验组MDA含量显著低于其他组（P<0.05）。

表4 维生素C添加水平对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响

3 讨论

3.1 维生素C添加量对克氏原螯虾生长的影响

维生素C作为一种水溶性维生素具有重要营养作用。邵光明等[5]报道，饲料中添加0.02%维生素C可显著提高克氏原螯虾的增重率，促进生长。甲壳动物体表硬化层由一种外壳蛋白和苯醌经交联作用而成，维生素C可通过影响苯醌的形成起到促进虾蟹蜕壳的作用，由此促进虾蟹的生长[6]。该试验中，维生素C对克氏原螯虾的存活率和饲料利用状况并无显著影响，但随着饲料中维生素C水平的提高，增重率和特定生长率呈先上升而后下降的趋势。侯迎梅等[7]在三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）幼蟹上也得出了类似的结论。由此表明，饲料中添加适量的维生素C（120 mg/kg）对克氏原螯虾具有显著的促生长作用，但是维生素C过量时增重率和特定生长率反而下降，可能过量的维生素C产生毒害作用抑制机体生长。左迪[8]对红螯光壳螯虾（Cherax quadricarinatus）的研究结果表明，饲料中维生素C的添加量为0～400 mg/kg时，虾的增重率和特定生长率显著上升。不同研究结果存在差异的原因可能与研究的物种、维生素C添加形式不同有关。

目前，关于维生素C对水产动物含肉率影响的研究鲜有报道，含肉率是评价鱼虾生产性能及经济价值的重要指标[9]。在该试验中，当饲料中维生素C添加量为480 mg/kg时克氏原螯虾的含肉率显著提高，这表明一定量的维生素C可促进克氏原螯虾肌肉的生长。本试验中克氏原螯虾含肉率最高为480 mg/kg Vc组（15.36±1.10）%，远低于洞庭湖中的20.21%[10]以及贵州湄潭稻田养殖的18.40%[11]，但高于水族箱养殖的12.83%[12]。造成差异的原因可能与初始规格、发育阶段、养殖模式、自然环境、水质条件、饲料组成等的差异有关[13]。

3.2 维生素C添加量对克氏原螯虾血浆免疫机能的影响

甲壳动物的免疫防御系统属于非特异性免疫系统，除了SOD等抗氧化指标外，碱性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶等也是重要的非特异性免疫指标，被广泛地用来评价虾类的健康状况、营养状况以及对环境的适应性[14]。

作为非特异性免疫生物防御因子，溶菌酶具有溶菌活性，并可以诱导其他免疫因子的合成和分泌[15-16]。ACP和AKP是虾蟹重要的非特异性磷酸水解酶[17]，直接参与磷酸基团的代谢和物质的摄取转运，可形成水解酶体系消除病原异物，与机体的生长存活息息相关。在血细胞进行吞噬和包囊反应中会伴有ACP的释放，参与病毒或细菌的识别、吞噬、降解[18]。

在该试验中，当饲料维生素C添加量为0～240 mg/kg时，克氏原螯虾血浆AKP、ACP与LZM活性随着饲料中维生素C添加水平的提高先上升后下降，这表明饲料中适量的维生素C能够影响克氏原螯虾的免疫防御机制，提高机体免疫活性和抗病力，而过量的维生素C导致一定的抑制作用，抵消部分免疫增强效用。随着维生素C含量的进一步增加，血浆AKP、ACP活性升高，这可能是机体的一种免疫补偿机制。这与侯迎梅等[7]在三疣梭子蟹幼蟹上的研究结果不一致，可能与试验对象的品种、养殖模式、生长阶段等不同有关，具体原因及作用机制还有待进一步研究。

3.3 维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺抗氧化能力的影响

抗氧化酶是由活细胞产生的几种生物催化剂，是抗氧化防御系统的重要组成部分，能够起到减缓氧化速度的作用，可将过氧化物转换为毒害较低或无害的物质，保护生物免受氧化损害[19]。SOD与CAT广泛分布在生物体内，可对产生的ROS进行解毒，将H2O2分解为H2O和O2以避免细胞损伤和病变[20-21]，维持生物体的正常代谢和体内环境动态平衡。MDA是膜脂质过氧化的最终分解产物，其含量能够反映出机体氧化损伤程度和清除自由基的能力[22]。因此，检测虾蟹组织中的SOD、CAT的活性和MDA含量的变化可以较为准确地反映机体的抗氧化状况。该试验结果显示，克氏原螯虾肝胰腺CAT活性以饲料中维生素C含量120 mg/kg为拐点呈先升高后降低的变化趋势，而肝胰腺MDA含量则随着饲料中维生素C含量增加而呈现先降低后上升的趋势，这说明饲料中适量的维生素C可有效提高克氏原螯虾抗氧化酶活性和降低脂质过氧化物MDA对机体的损害，从而增强机体的抗氧化功能，但进一步增加维生素C含量则会损伤机体抗氧化系统。在该试验中，不同维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺SOD活性没有显著影响，与周歧存等[23]对凡纳滨对虾（Prawns vannamei）的研究结果一致，可能是由于动物体内的两大抗氧化体系协同作用，在机体内发挥自由基清除作用。

4 结论

对克氏原螯虾的适宜维生素C添加量为120 mg/kg，可显著促进克氏原螯虾的生长，提高血浆LZM、AKP及ACP活性，同时提高克氏原螯虾肝胰腺的抗氧化性能，降低MDA含量。若维生素C添加量继续增加，则会导致克氏原螯虾增重率及特定生长率下降，降低免疫酶活力，这可能与维生素C过量使用导致的抑制作用有关。