马冠状病毒感染:马的新发病毒性传染病

2021-06-05 11:48朱来华赵丽青郑小龙邓明俊肖西志孙明君
中国动物检疫 2021年6期
关键词:马驹胃肠道粪便

朱来华,吴 华,王 群,赵丽青,郑小龙,邓明俊,肖西志,孙明君

(青岛海关,山东青岛 266002)

1999年,在美国北卡罗来纳州腹泻马驹的粪便中分离到马冠状病毒(equine coronavirus,ECoV)毒株(NC99)[1]。自2010年以来,日本、美国、巴西以及部分欧洲国家(法国、爱尔兰、英国等)均有发现零星病例的报道[2-3]。虽然我国尚无ECoV感染的报道,但仇钰等[4]用自制的ELISA方法,从711份国内马血清中检出13份阳性(1.83%)。目前尚缺乏详细的ECoV流行情况的调查资料。据有限的文献[5]推测,ECoV可能以无症状感染形式广泛分布于全世界马群。

目前尚不清楚ECoV危害情况。幼龄马驹和成年马均可被感染,其他动物是否可以感染ECoV,目前还没有相关调查或报道。通过荧光定量PCR(qPCR)检测发现,健康马驹和临床发病马驹的ECoV阳性检出率相似[6]。成年马ECoV感染的发病率为10%~83%[7-10],临床症状多表现为发烧、嗜睡、厌食,较少见到腹痛和腹泻。大多数的马ECoV感染是自限性疾病,死亡很少,通常不需要或只需要有限的支持性治疗就会康复。目前还没有可供使用的ECoV疫苗。该病预防仅限于基本的生物安全措施。本文综述了ECoV的病原学、流行病学、临床诊断、实验室诊断以及感染的治疗和预防等内容,以期为防控该病提供参考。

1 病原学

1.1 分类和命名

冠状病毒科(Coronaviridae)所有成员均为单链、正股、不分节段、包有囊膜的RNA病毒,主要引发哺乳动物和鸟类的呼吸道、肠道、肝脏或神经系统疾病。在冠状病毒科正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)内,根据血清学交叉反应性和遗传同源性可细分为4个属:α 冠状病毒、β 冠状病毒、δ 冠状病毒和γ 冠状病毒[11]。

ECoV是β 冠状病毒属成员,同属的还有牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCoV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine haemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)、犬呼吸道冠状病毒(canine respiratory coronavirus)、非洲羚羊冠状病毒(bubaline coronavirus)、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus)和大鼠涎腺泪腺炎冠状病毒(sialodacryoadenitis rat coronavirus)以及人冠状病 毒(human coronaviruses,HCoV)OC43、4408和HKU1等[12]。

1.2 形态结构和化学组成

冠状病毒的核衣壳蛋白与基因组RNA一起在病毒囊膜内形成螺旋状衣壳结构。纤突蛋白(spike protein)的三聚体(trimers)形成嵌入在囊膜中的膜粒突起(peplomers),使其具有冠状或类冠状形态。

此外,病毒粒子的两个结构蛋白,分别称为膜蛋白和小膜蛋白,是完全跨膜蛋白[13]。血凝素酯酶蛋白在ECoV膜上形成较小的纤突。

1.3 生物学特性

目前尚不清楚ECoV作为感染源在环境中持续的时间。在室温下,其他冠状病毒,如严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV),可在医院废水、生活污水和脱氯自来水中持续2 d,在粪便中持续3 d,在PBS中持续14 d,在20 ℃的尿液中持续17 d。在较低温度下生存时间可能更长。4 ℃时,SARS-CoV可在废水中持续14 d,在粪便或尿液中持续至少17 d[14]。

ECoV对次氯酸钠、聚维酮碘、葡萄糖酸氯己定、酚类、季铵化合物、过氧化氢和过氧化合物等常用消毒剂敏感。

1.4 基因组结构和功能

ECoV基因组长为30 992个核苷酸(不包括poly A尾),5'和3'端均有短的非翻译区(UTR),GC含量为37.2%。ECoV可能有11个开放阅读框(1a、1b、2~8、9a和9b),分别编码2个复制酶多聚蛋白、5个结构蛋白(血凝素酯酶、纤突、囊膜、膜蛋白和核衣壳)和4个辅助蛋白(NS2、p4.7、p12.7和I)。据预测[12],2个复制酶多聚蛋白被由3个病毒编码的蛋白酶分解为16个非结构蛋白(nsp1~16)。ECoV的基因组结构模式见图1。

图1 ECoV基因组结构模式[12]

1.5 病毒遗传变异

ECoV与同属的3种冠状病毒(BCoV、HCoV-OC43和PHEV)系统发育最密切相关,与其同源性分别为67%、67%和45%。比较这4种冠状病毒,ECoV nsp3蛋白具有大量的氨基酸缺失和插入。ECoV在1999年从美国的腹泻马驹中分离出来,出现时间早于PHEV、BCoV和HCoV-OC43[12]。已发现4个ECoV分离株的全基因组序列,其中1株来自美国,3株来自日本[12,15]。来自日本的3个分离株与来自美国北卡罗来纳州的分离株(NC99)密切相关,序列同源性为98.2%~98.7%[15]。

1.6 致病机制

多年以来一直怀疑ECoV可引起马驹肠炎,实际在健康或腹泻的马驹中均可检测到ECoV,这表明ECoV通常在表现亚临床症状的幼龄马群内流行。ECoV感染后的马驹缺乏临床体征的原因可能是宿主因素,如马驹缺乏特定的受体结合位点或结肠内存在ECoV特异性母源抗体,可阻止肠炎发生。所有患有胃肠道疾病的马驹都与ECoV和其他病原的合并感染有关,而大多数无症状马驹则是ECoV单一感染[6]。这一结果表明,ECoV感染可能会导致继发性病毒、细菌或原虫感染[16-17]。在临床感染的成年马中,主要为ECoV单一感染。这说明感染动物的年龄会影响ECoV的致病性。

据报道[18],猫冠状病毒(feline coronavirus,FCoV)致病性与宿主年龄有关,2岁以下的猫多发展成猫传染性腹膜炎(FIP),年龄较大的猫多表现为慢性病例。FCoV强毒基因型对体液、细胞介导或混合免疫反应,明显影响冠状病毒感染的临床症状。另外,自然杀伤细胞和T调节细胞的严重抑制与临床症状相关,即细胞介导的免疫反应减弱与强毒基因型感染有关[19]。

Fielding等[10]报告了一例出现脑病迹象的严重高氨血症病例(677 μmol/L,参考区间≤60 μmol/L)。与ECoV感染相关的高氨血症可能是由于胃肠道屏障破坏,导致氨从胃肠道吸收增加。另外,与ECoV感染有关的细菌微生态变化,也可能使肠道氨产量增加。试验[9-10,20]证明,死亡率与内毒素血症、败血症和高氨血症引起的相关脑病有关。

2 流行病学

2.1 传染源

病马或无症状感染马可通过粪便排出病毒,是潜在的传染源。

2.2 传播途径

ECoV通过粪—口途径传播,马直接摄入被粪便污染的饲料和饮水或间接接触病毒污染的物品而受到感染。

初步流行病学观察支持粪—口传播途径,并得到了实验性研究支持。该项研究[15]用ECoV感染马的粪便材料,通过鼻食管插管成功感染3匹9~10月龄的日本挽马,其中2匹发生了临床疾病,并在粪便中排出了大量ECoV。

在患有传染性上呼吸道疾病的马鼻腔分泌物中很少检测到ECoV,表明ECoV与呼吸道上皮缺乏亲嗜性。3匹实验感染的日本挽马中,在粪便排毒高峰期间,鼻腔分泌物为ECoV PCR阳性,但无法确定这是由于病毒在鼻腔复制和排出,还是来源于阳性粪便污染的环境,或两者兼而有之[15]。

2.3 易感动物

幼龄马和成年马均易感,但ECoV临床感染主要见于成年马。据报道[7-10]:ECoV感染主要在骑乘、比赛和展览马匹中暴发;而育种动物发病率较低,只发现纽约州的两个育种养殖场发生了ECoV感染。

不同年龄马的ECoV感染率明显不同,0~6月龄为20.5%,>6月龄~5岁为25.3%,5岁以上为54.2%。

在健康或腹泻的马驹中均可检测到ECoV。在两项研究[16-17]中,来自两个地理区域的结果却有所不同。在日本北海道日高地区,所有337匹腹泻马驹直肠拭子ECoV均为阴性,而健康马驹的3/120(2.5%)直肠拭子为ECoV阳性。然而,在美国肯塔基州中部进行的研究发现,在健康和腹泻马驹粪便中检测到ECoV的比例相似。

研究[9]显示,用qPCR检测6月龄以下马驹的粪便病毒载量似乎低于超过12月龄的马,尽管这一差异没有统计学意义(P=0.307),但表明马驹和大龄马在肠道中的病毒复制情况不同。在HCoV感染中,病毒载量是临床症状和死亡率的一个强有力的预后指标[21]。

2.4 流行特点

ECoV感染的发病率不一,为10%~83%[7-10]。据报告[7-9],ECoV感染死亡率很低。但Fielding等[10]报道,美国小型马的死亡率为27%。2015年,在美国另一微型马育种养殖农场发生严重但非致命的ECoV感染[10]。美国微型马对ECoV易感性明显增加,其原因有待进一步研究。

一年四季均有ECoV感染散发病例,但寒冷季节更常见。在较冷月份(10月至来年4月),ECoV qPCR检测阳性数量较高,表现为粪便样本阳性率和临床发病率较高,这与BCoV所见的季节性疾病模式相似。

在法国对患有呼吸道或胃肠道症状的幼年和成年马研究中,qPCR检测发现2.8%(11/395)的粪便样本和0.5%(1/200)的鼻拭子呈ECoV阳性[22]。患有发烧和呼吸道症状马的2 437份鼻分泌物中有常见的呼吸道病毒,其中17匹马(0.7%)呈qPCR阳性[9]。来自沙特阿拉伯和阿曼无症状马的5份直肠拭子(1.6%)经PCR证实ECoV阳性,但未在鼻拭子中检出阳性[23]。这些研究表明,健康马和呼吸道感染马的鼻分泌物中很少检测到ECoV。

ECoV潜伏期短,常在自然暴露或实验感染后48~72 h内发展成临床疾病[10,15]。临床症状持续几天到1周,通常在最低限度的支持性治疗下痊愈。偶尔,临床症状可以持续更长时间(如14 d)。

2.5 分子流行病学

ECoV的分子流行病学研究尚处于空白状态。冠状病毒变异可以影响其复制能力和病毒载量。FCoV有两种基因型:温和基因型为猫肠道冠状病毒(feline enteric coronavirus,FECV),在肠细胞中的复制能力较低;强毒基因型为猫传染性腹膜炎病 毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV),在不同细胞系中的复制能力较强[18-19]。纤突基因上的单位点突变可导致细胞亲嗜性、复制能力和临床表现的显著变化[18]。

3 临床诊断

3.1 临床症状

ECoV以隐性感染为主,即使出现临床症状也比较温和,如出现胃肠道症状,而且临床症状不具有特征性。

从2011年11月至2014年12月期间的16次暴发中收集了406匹马的临床信息,结果有122匹马(30%)表现出临床症状[8],主要表现为厌食(98%)、嗜睡(89%)和发热(84%)。发热马的直肠温度为38.6~41.0 ℃。出现临床症状时,25%的马粪便呈稀软状到水泄状,18%的马出现腹痛。胃肠道症状一般在厌食和发热等全身症状后出现。

这些与日本2013年暴发的成年挽马ECoV感染一致,其主要临床体征是嗜睡、厌食和发热,在约10% 的感染马匹中观察到了特定的胃肠道体征[6-7]。据报道[9-10],3%的临床感染马出现脑病迹象,如转圈、压头、共济失调、本体感受障碍、眼球震颤、躺卧和癫痫等。因此,对疑似ECoV感染和并发脑病迹象的马进行血氨测定也有诊断意义。

ECoV感染后,部分马表现为无症状感染,应用qPCR从粪便中可检测出ECoV[7-10]。ECoV感染暴发期间,无症状感染的比例为11%~83%[9]。

3.2 剖检病变

Giannitti等[20]观察了3匹成年马ECoV感染后的病理学变化,主要表现为严重的弥漫性坏死性肠炎、绒毛尖端上皮细胞坏死、中性粒细胞和纤维蛋白外渗进入小肠腔(假膜形成),并出现隐窝坏死、微血栓和出血。在所有病例的小肠组织、胃肠道内容物和/或粪便中,采用qPCR可检测到冠状病毒核酸;在所有病例的小肠上,采用免疫组织化学和/或直接荧光抗体可检测到冠状病毒抗原。

3.3 病理变化

ECoV感染的血液学异常表现为白细胞减少,即中性粒细胞减少和/ 或淋巴细胞减少。来自73例怀疑ECoV感染的临床病例血象表明,有核细胞计数范围为0.5~7.891 09/L(中位数为3.491 09/L,参考区间5.0~11.691 09/L)。73匹患病马白细胞血计数显示,白细胞减少25%,中性粒细胞减少66%,淋巴细胞减少72%。这些马的中性粒细胞和淋巴细胞计数分别为0.2~5.191 09/L(中位数1.691 09/L,参考区间2.6~6.891 09/L)和0.8~3.691 09/L(中位数1.191 09/L,参考区间1.6~5.891 09/L)。仅在11%的马匹中,总血细胞计数(complete blood count,CBC)和分型白细胞计数变化都不显著[9]。

3.4 鉴别诊断

马的胃肠道疾病可能有多方面原因导致,既有病原微生物感染,也有非炎性疾病(非甾体抗炎药中毒)引起。马的胃肠道致病性微生物包括病毒(ECoV、马轮状病毒)、细菌(产气荚膜梭菌、艰难梭菌、毛状梭菌、沙门氏菌、马红球菌、胞内劳森菌)、寄生虫(隐孢子虫、大圆形线虫、小圆形线虫)、立克次体等。饲料改变、肠道菌群或环境改变以及中毒等因素引起肠内正常生理过程的破坏,也可能导致腹泻。

由于ECoV感染引起的临床症状不是特征性的,因此确诊需要通过PCR、免疫组化和/或电镜检测粪便、肠内容物、肠组织中的ECoV核酸或抗原。

4 实验室诊断

ECoV实验室诊断主要包括血液学检测和粪便中ECoV的分子检测。

4.1 血象检测

ECoV感染的血象检测表现为白细胞减少,如中性粒细胞减少和/或淋巴细胞减少。

4.2 血清学检测

目前尚无可靠的ECoV血清学检测技术。Guy等[1]、仇钰等[4]、Davis[24]建立了检测ECoV抗体的ELISA,但没有商品化ELISA检测试剂盒。

4.3 病毒分离鉴定

活动物可采集胃肠道内容物和/或粪便,死亡动物可采集小肠组织、胃肠道内容物和/或粪便。利用人直肠腺癌细胞分离ECoV,尽管很困难,但也有报道[1]。病毒分离鉴定繁琐耗时,使得ECoV感染的诊断局限于生物样品中的病毒抗原或特异性核酸的直接检测。

最初一般使用负染电镜(EM)和抗原捕获ELISA来检测粪便中的冠状病毒[1,24],后来用免疫化学和直接荧光抗体试验来检测小肠组织ECoV抗原[20],现在多用qPCR方法来检测病毒核酸。

4.4 分子生物学技术

Tsunemitsu等[25]、姜焱等[26]建立了ECoV的RT-PCR检测方法,Pusterla等[9]、Fielding等[10]、Nemoto等[15]建立了qPCR方法,但目前没有商品化PCR检测试剂盒。Pusterla等[9]评估了qPCR的总体准确性。在不同的暴发马群中,确定ECoV临床状态与qPCR检测之间具有90%准确性;在疾病早期阶段,几例ECoV感染呈qPCR阴性,但在24~48 h复查时,粪便样本呈现qPCR阳性。

实验感染马匹粪便中的ECoV病毒动力学表明,马在感染后3 d或4 d开始在粪便排出ECoV RNA,排毒时间持续到感染后12 d或14 d[15]。排毒高峰一般在出现临床症状3~4 d后。在自然感染的马中,qPCR检测到ECoV的时间可以持续3~25 d[9-10]。

5 预防与控制

5.1 疫苗

目前尚无ECoV疫苗可供使用。动物冠状病毒疫苗已应用于牛的免疫,如使用减毒BCoV疫苗来预防牛冬季痢疾[27]。实验性感染BCoV后,康复牛保持长期的特异性血清抗体(IgA和IgG)和局部抗体(IgA)[28]。尽管BCoV与ECoV密切相关,但由于缺乏安全性和有效性数据以及零星发病状况,目前不推荐使用BCoV疫苗预防ECoV。

5.2 抗病毒药物

目前尚无抗ECoV的特性药物可供使用。大多数具有ECoV感染临床症状的成年马在几天内可自发康复,而无需特殊治疗。体温持续升高、厌食和沉郁的马,如果电解质正常,通常使用非甾体抗炎药物,如氟尼辛·梅洛明、苯基丁酮。患有腹痛、持续沉郁和厌食和/或腹泻的马,可补充电解质。此外,在马继发性内毒素血症和/或败血症时,应考虑使用抗菌药物和胃肠道保护剂。虽然高氨血症相关脑病只发生在很少部分ECoV感染马,但早发现和早治疗往往可以得到积极的效果。疑似或已有高氨血症的马,可使用口服用乳果糖、硫酸新霉素或粪便移植(faecal transfaunation)等进行治疗。

5.3 其他措施

对于ECoV感染与传播的控制,没有特殊的防控措施,只需要实施基本的生物安全措施,减少ECoV传入马所在场所的概率。对新引进的马应隔离至少3周。根据具体情况,在外表演或比赛而返回的马匹也应进行适当时间的隔离。马车和拖车在使用前后应彻底清洁和消毒。在加强马所在场所(存养设施、表演场地或兽医院)防控措施时,应使用消毒脚垫和个人防护设施,及时清理粪便,定期对马存养或活动场地进行清洁和消毒。马出现肠胃症状(腹痛、腹泻),或全身症状,如发烧(38.5 ℃)、厌食和嗜睡,或通过qPCR确认ECoV感染,应严格隔离;同群的其他马或与之密切接触的马在其他设施隔离,每天临床检查,并两次测量体温。马僮和其他人员应先照护健康动物,最后照护感染或疑似感染动物,并对马靴、马钉和手进行清洁和消毒。感染赛马的训练时间应与健康马错开,训练时骑手应穿戴防护服。

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