基于 UPLC-Q/TOF-MS 研究蚕砂不同炮制品主成分差异

★ 熊之琦 李莹 徐媛 李诗盈 蔡教邕 吕齐 曹娟 叶喜德（.江西中医药大学 南昌 330004；.江西省儿童医院 南昌 330006）

蚕砂是我国传统中药，为蚕蛾科家蚕（Bombyx moriL.）的干燥粪便，又名原蚕砂、晚蚕砂、蚕屎、蚕粪［1］。我国大部分养蚕地区皆产，蚕砂性温，味甘辛，入肝脾经，具有清热祛风、利湿化浊、活血通络、镇静安神等功效。故能养血化瘀、补气健脾，是一味治疗贫血的良药。蚕砂在历代本草多有收录，如《名医别录》：“主肠鸣，热中消渴，风痹，瘾疹。” 《本草纲目》：“治消渴，癥结，及妇人血崩。”《本经逢原》：“蚕砂，疗风湿之专药。”主要用于治疗中风、半身不遂、肠鸣、消渴症、血崩和血虚等证。研究表明［2］，蚕砂化学成分主要包括生物碱、黄酮、木质素、萜类、植醇、叶绿素盐、氨基酸等，具抗肿瘤、保肝、抗病毒、补血、抗炎、抗菌及治疗糖尿病等多种药理作用。

虽然历代古籍对蚕砂炮制有记载，如唐《本草拾遗》载：“炒黄，袋盛浸酒，去风缓诸节不遂”，且在古籍方剂中，炒制后的蚕砂应用较为常见。而历版《中华人民共和国药典》均未收录蚕砂，仅部分地方炮制规范有收录，但仍缺乏现代研究内容。蚕砂作为处方药在临床使用，常以生品和炒制品。中药在应用前多经炮制处理，但蚕砂经炮制后是否会增加药效，目前研究仍属空白。另一方面，炮制的目的是减毒增效，也就是通过炮制后药材发生的成分变化来实现的。

因此，研究炮制对化学成分变化差异，是探讨中药炮制机理的关键，也是优选饮片质量的重要依据。由于炮制中的炒制品分为炒黄、炒焦、炒炭等三类。基于此，本研究选择蚕砂不同炒制品与生品为考察对象，运用UPLC-Q/TOF-MS并结合多种分析方法，分析它们之间主成分差异，为揭示蚕砂炮制机理提供数据支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器Triple TOFTM5600+型色谱仪（美国AB SCIEX 公司，配备 DuoSpray TM离子源，30A型液相色谱系统），AE240 型 1/10 万电子分析天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，TGL-16B 型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药1-脱氧野尻霉素、维生素A对照品（四川省维克奇生物科技有限公司，批号分别为WKQ19030501、WKQ19012803 纯度均≥98%），蚕砂由安徽汇仁堂中药饮片有限公司提供，经江西中医药大学龚千锋教授鉴定为蚕蛾科家蚕Bombyx moriL.的干燥粪便。水为纯净水，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 炮制品制备炒蚕砂：称取蚕砂生品40 g，文火加热翻炒3 min，炒成表面颜色加深。焦蚕砂：称取蚕砂40 g，中火加热翻炒3 min，炒制表面焦褐色。蚕砂炭：称取蚕砂40 g，200 ℃翻炒4 min，至里外均为焦黑色，可轻捏成粉末即可。

2.2 供试品制备精密称取蚕砂不同炮制品粉末各2 g（过2号筛），精密加入75 %甲醇7.5 mL，混匀，超声提取30 min，取出，离心（4 000 r/min，10 min），取上清液，连续提取3次，合并上清液，经 0.22 μm 滤膜滤过，合并滤液，待测。

2.3 对照品溶液制备分别精密称取1-脱氧野尻霉素、维生素A对照品约2 mg，加甲醇定容于10 mL量瓶中，即得各对照品储备液。分别以甲醇稀释，离心，0.22 μm滤膜滤过，待测。

2.4 色谱条件Ultimate AQ-C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相0.1 %甲酸水（A）-乙腈（B）梯度洗脱（0～3 min，5 %～12 %B；3～12 min，12 %～40 %B；12～35 min，40 %～90 %B；35～40 min，90 %～95 %B；40～42 min，95 %B；42～45min，5 %B），流速0.25 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。

2.5 质谱条件采用电喷雾电离源（ESI），正、离子模式扫描，质量扫描范围为m/z50-1250。采用母离子触发的子离子（TOF-MS-IDAMS/MS）扫描方式，MMDF和DBS为触发二级的条件。正离子模式：喷雾电压（ISVF）4 500 V，去簇电压（DP）100 V，气帘气（CUR）30 psi，雾化气温度（TEM）500 ℃，雾化器（GS1）和辅助气（GS2）均为50 psi，碰撞能量（CE）30 eV，碰撞能量叠加（CES）±10 eV，数据采集时间45 min。负离子模式：喷雾电压（ISVF）-4 500 V，去簇电压（DP）-100 V，气帘气（CUR）30 psi，雾化气温度（TEM）500 ℃，雾化器（GS1）和辅助气（GS2）均为50 psi，碰撞能量（CE）-30 eV，碰撞能量叠加（CES）±10 eV，数据采集时间为45 min。

2.6 化合物鉴定通过文献［3-5］和化学数据库（Chemspider、Pubchem、Scifinder）收集得蚕砂化学成分名称、分子式的数据库，将此导入PeakView 2.1工作站的XIC Manager 版块中，依照匹配分子离子、保留时间、二级碎片、对照品和文献资料，在正、负离子模式下，分离并鉴别出蚕砂30个化合物。其中黄酮类8个，生物碱类2个，氨基酸类4个，苯丙素类6个，核苷类、维生素类、脂肪酸类等10个。见表1。

2.7 化合物裂解规律分析

2.7.1 黄酮类 黄酮类化合物在高能量碰撞裂解过程中，容易发生脱糖基、脱水，CHO、CO2、CO等中性分子丢失，并使C环的逆狄尔斯－阿德尔反应（RDA）裂解而产生特征碎片离子。以紫云英苷为例，在负离子模式下，其碎片峰m/z447.0922［M-H］-，丢失一分子葡萄糖得碎片离子m/z285.0381［M-H-Glu］-，再脱去1个H得m/z284.0312［M-H-Glu-H］-，或先脱去2个H又脱去一分子CO得m/z255.0288，比照文献［5］，推测该化合物为紫云英苷，其二级质谱图和可能裂解途径见图1。

2.6.2 氨基酸类 在高能量碰撞下，该类成分易丢失中性分子NH3与COOH，从而形成特征碎片离子。以L-苯丙氨酸为例，在正离子模式下产生离子峰m/z166.086 3［M+H］+，丢失一分子NH3得碎片离子m/z149.042 3［M+H-NH3］+，或丢失一分子COOH，得到碎片离子m/z120.081 6［M+H-COOH］+，其中碎片离子m/z149.042再脱去一分子COOH，得m/z103.0555［M+HNH3-COOH］+，比照文献［4］，推测该化合物为L-苯丙氨酸，其二级质谱图与可能裂解途径见图2。

图2 L-苯丙氨酸裂解途径及质谱图

2.6.3 苯丙素类 本研究共鉴定出6个苯丙素类化合物。以绿原酸为例，在正离子模式下，绿原酸离子峰为m/z355.102 4［M+H］+，失去咖啡酰基，得m/z193.049 9［M+H-C9H6O3］+，再失一分子H2O和CO2，分 别 得m/z181.026 4［M+H-C9H6O3-H2O］+、m/z137.059 4［M+H-C9H6O3-H2O-CO2］+。依 照 保留时间、裂变轨道和分子离子峰等信息，并结合文献，推测该化合物为绿原酸。绿原酸的二级质谱与可能的裂解途径见图3。

图3 绿原酸裂解途径及质谱图

2.6.4 生物碱类 在已鉴定出的生物碱成分中，1-脱氧野尻霉素在正离子模式下，得分子离子峰m/z164.091 7［M+H］+，经高能量碰撞得3个碎片离子。分别为m/z96.045 5 ［M+H-(OH)4］+、m/z82.066 3［M+H-CH6O4］+、m/z69.035 5 ［M+H-C2H7O4］+。与对照品相比，其产生的二级碎片离子一致，最终推测该化合物为1-脱氧野尻霉素，其二级质谱与可能的裂解途径见图4。

图4 1-脱氧野尻霉素裂解途径及质谱图

2.6.5 其他化合物 鸟苷为核苷类化合物，以鸟苷为例，在正离子模式下得分子离子m/z284.099［M+H］+，脱去糖苷元后得m/z152.057 2［M+H-Rib］+，该碎片离子再脱去一分子羟基，得m/z135.030 7［M+H-Rib-OH］+。其二级质谱和可能裂解途径见图5。

图5 鸟苷二级裂解途径及质谱图

2.8 蚕砂不同炮制品在正离子模式下离子峰面积炮制前后变化指数考察炮制前后成分含量变化，在相同条件下，常以色谱峰面积为对比参数。同时采用变化指数进行比较，即变化指数（change index，CI）=炮制品离子峰面积/对应保留时间的生品离子峰面积，其值＞1表示此离子峰对应成分含量在炮制后增加，＜1表示此离子峰对应成分含量在炮制后降低，=1表示炮制前后无变化。

结果表明，蚕砂炒制后，未见新成分产生，但有个别成分因含量太低未被检测到，且部分化学成分含量变化明显。蚕砂经炒黄后，有7个化学成分的峰面积明显升高（CI＞1.5），有5个成分的峰面积降低（CI＜1）；蚕砂经炒焦后，有11个成分的峰面积显著升高,有11个成分的峰面积降低；蚕砂经炒炭后，有6个成分的峰面积明显升高，有14个成分的峰面积降低，其中有10个成分显著降低（CI＜0.5），如表2。

表2 蚕砂不同炮制品峰面积变化指数

（续表）

2.9 UPLC-Q/TOF-MS数据分析

2.9.1 主成分分析（PCA） 将液质数据导入Markview软件进行峰提取、峰对齐及归一化等处理，再利用SIMCA 13.0软件进行PCA处理。由图6可知，在正、负离子模式下，各组样本点之间离散性较小，表明各组样品自身差异较小，组内均一性良好，蚕砂四个炮制品之间可明显区分，且蚕砂炭与其他炮制品距离较大，说明炒炭对蚕砂化学成分影响较大。

2.9.2 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA） 采用两两比较的方式，利用OPLS-DA模型对生品蚕砂、炒蚕砂、焦蚕砂和蚕砂炭的差异成分进行筛选，其差异成分用变量重要性投影（VIP）值及S-plot图来表现。将VIP＞1的成分变量作为该模型的重要标记物，且VIP值越大说明该成分变量越重要［6］；S-plot图上X 轴表示变量的贡献值，距离零点越远的点对两组间的差异贡献值越大，Y 轴表示变量的可信度，点距离零点越远，表明该点对组间差异具有较高的置信水平［7］。筛选得各组间的差异成分见表3，以生蚕砂、蚕砂炭为例，其S-plot图见图7。

图6 生蚕砂（SA-SC）、蚕砂炭（TA-TC）、焦蚕砂（JA-JC）、炒蚕砂（HA-HC）的PCA得分图

表3 蚕砂不同炮制品的差异成分

图7 正离子模式（A）、负离子模式（B）生蚕砂与蚕砂炭S-plot图

3 讨论

蚕砂为蚕之代谢产物，而蚕以桑叶为食，其所含成分较复杂。蚕砂在不同程度的炒制过程中，由于会涉及到加热环节，势必会影响到药物的化学成分，进而影响到药效。但针对炮制对蚕砂的研究，目前文献仍属空白。基于此，本研究运用UPLCQ/TOF-MS分析蚕砂炮制前后成分变化差异，目的是为研究蚕砂炮制机理奠定基础。

本研究运用UPLC-Q/TOF-MS技术，并结合保留时间、质谱信息和文献资料，共鉴定蚕砂化学成分30个。结果表明，蚕砂经炮制后，其各成分含量均发生了变化。PCA模式下，蚕砂不同炮制品均可明显区分开来，其中蚕砂炭分离度尤为明显。且经OPLS-DA分析发现，布卢门醇C葡糖苷、秦皮甲素、东莨菪内酯、芦丁、紫云英苷等共12种成分为蚕砂炮制前后的差异标志物，其中筛选得蚕砂炒黄前后与炒焦前后的差异成分各有8个，蚕砂炒炭前后的差异成分共有10个。差异成分中芦丁、紫云英苷、异槲皮苷、melilotoside、quercetinhexoside-hexo-side、kaempferol hexoside-rhamnoside均为黄酮类成分，文献研究表明［8-9］，蚕砂中的黄酮类成分具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的药理作用；另外，秦皮甲素同样具有抗菌抗炎、抗肿瘤的生物活性，而东莨菪内酯除抗菌抗炎与抗肿瘤药理作用外，还具有降压、降血脂与保肝等其他药理活性。通过分析各差异成分在不同炮制品中的差异趋势发现，炒蚕砂8个差异成分含量均升高；焦蚕砂6个成分含量升高，2个成分含量降低；蚕砂炭2个成分含量升高，其它8个成分含量均降低，故推测炒黄蚕砂为蚕砂的优势炮制品种。秦皮甲素、芦丁、紫云英苷等成分可能是蚕砂抗炎、抗菌、抗肿瘤的有效成分，故推测炮制后上述成分含量的变化可能是蚕砂炮制后药效增强或缓和的原因之一。

综上所述，炮制对蚕砂化学成分产生了影响，且在蚕砂的各个炮制品中，炒黄蚕砂为优势炮制品种，这为临床常用炒黄蚕砂与其他药物配伍应用提供了数据支撑，但蚕砂经炮制后药效作用变化机制，仍需从药效试验中进行深入研究，希望本研究能为深入研究蚕砂提供参考。