水酶法提取山苍子核仁油工艺的研究

赖鹏英 黎继烈 肖志红 唐 娟 张爱华,

(中南林业科技大学1，长沙 410004)(湖南省林业科学院2，长沙 410004)

山苍子Litseacubeba(Lour) Pers又名山鸡椒、木姜子，是樟科木姜子属落叶小乔木，主要分布在我国湖南、广西、福建等地，是一种重要木本油料植物[1]。山苍子果实应用价值高，常被用来提取山苍子精油。在提取山苍子精油过程中会产生大量的核仁残留物，全国每年约有20万t山苍子核仁残留物被直接被丢弃，造成资源的巨大浪费[2, 3]。山苍子核仁来源丰富，油脂含量高达40%，其脂肪酸成分与椰子油相似，在一定程度上可替代椰子油，具有较高经济价值，但由于缺乏技术的指导和资金投入，一直没有得到良好开发[4]。

工业提取植物油一般采用溶剂萃取法，若需考虑无化学污染的提取方法则选择物理压榨法[5]。压榨法通过机械挤压油料提取油脂，是最常用的方法，但存在出油率低、出油速度慢等缺点。溶剂萃取法是利用油脂可溶于有机溶剂的特性萃取油脂，出油率较高，但需要脱溶剂过程[6]。超临界CO2萃取能显著提高出油率，但技术和设备要求较高，不易放大生产[7]。随着我国对环境保护的重视及人民健康意识的提升，水酶法提取油脂因其安全性佳、设备简单、条件温和、能耗低、效率高的显著优势被业界广泛认可[8]。前期研究证明水酶法在提取无患子籽仁油[9]、牡丹籽油[10]、红树莓籽油[11]、大豆油[12]、葵花籽油[13]、蓖麻籽油[14]、樱桃种子油[15]上均有良好效果，然而利用水酶法提取山苍子核仁油鲜有报道。本研究以山苍子核仁为原料,探究不同实验条件复合酶对山苍子核仁油提取率的影响，并对水酶法提山苍子核仁油工艺条件进行优化，以期为该工艺的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山苍子核仁、纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶；氢氧化钠、盐酸为分析纯；乙腈、丙酮为色谱纯。

1.2 仪器与设备

SY-2230恒温水浴摇床，FA1204B电子分析天平，AZC-02多功能粉碎机，DF-101s集热式恒温磁力搅拌器，TDL5M台式低速离心机，SZF-06A粗脂肪测定仪，FE20实验室pH计，IS5型傅里叶红外光谱仪，Scion-SQ型单四级杆气质联用仪。

1.3 方法

1.3.1 水酶法提取山苍子核仁油

将150 ℃烘烤3 h后的山苍子核仁用多功能粉碎机粉碎90 s，准确称重20 g后调制合适液料比(水与山苍子核仁体积质量比，下同)，待温度上升至实验设计温度时用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调节pH，加入一定比例的酶(以山苍子核仁质量计，下同)，反应结束后100 ℃水浴灭酶10 min，将酶解产物冷却至室温，置于离心机中5 000 r/min离心20 min，离心结束取上层清油，计算提取率。

(1)

1.3.2 山苍子核仁含油率的测定方法

山苍子核仁含油率的测定方法参考GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量测定》。

1.3.3 复合酶制剂筛选实验

研究以酶的种类(纤维素酶、果胶酶、α淀粉酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶)、酶的复配(1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3) 、酶的用量(1%、2%、3%、4%、5%)为影响因素进行复合酶制剂筛选实验，先筛选出2种效果最佳的酶，再固定其复配及用量。

1.3.4 单因素实验

研究分别以酶解pH(3、4、5、6、7)、液料比(1、3、5、7、9 mL/g)、酶解温度(35、40、45、50、55 ℃)、酶解时间 (1、3、5、7、9 h)为影响因素进行单因素实验，研究各因素对山苍子核仁油提取率的影响。

1.3.5 响应面优化

采用Box-Behnken中心组合实验设计方案，在单因素实验基础上，选取对酶解反应影响较大的3个因素进行响应面设计，建立山苍子核仁油提取率的回归方程，优化山苍子核仁油提取工艺参数。

1.3.6 山苍子核仁油的傅里叶红外分析

利用傅里叶红外(FT-IR)检测水酶法最佳工艺条件下提取的山苍子核仁油的化学结构、官能团组成。

FT-IR检测条件[16]：检测器为中红外DTGS检测器，分辨率为4.0 cm-1，采集空气为背景，采集次数设为16次，波数扫描范围为400.0～4 000.0 cm-1。

1.3.7 山苍子核仁油的脂肪酸成分分析

采用气象色谱/质谱联用仪(GC-MS)测定山苍子核仁油的脂肪酸组成成分。

样品预处理：对样品进行甲酯化处理，参考GB 5009.168—2016方法。山苍子核仁油GC-MS检测条件[17]：色谱柱为HP-5弹性石英毛细管柱30 mm×0.25 mm×0.25 μm，载气为He，流量2.0 mL/min；正己烷为溶剂；进样口温度280 ℃，分流比10∶1；传输线温度280 ℃，EI离子源，电离电压70 eV，电子倍增电压980 V，溶剂延迟10 min，离子源温度250 ℃，质荷比范围50～550，5次/s全扫描。

2 结果及分析

2.1 复合酶制剂筛选实验

2.1.1 酶种类的初步筛选

在料液比为2 mL/g，酶解反应时间7 h，加酶量4%条件下，考察纤维素酶(50 ℃，pH4.8)、果胶酶(50 ℃，pH3.0) 、α-淀粉酶(60 ℃，pH6.0) 、中性蛋白酶(40 ℃，pH7.0) 、碱性蛋白(50 ℃，pH8.0)对山苍子核仁油提取率的影响。由图1可知，每种酶在适当条件下都能促进核仁油的提取，而蛋白酶对山苍子核仁油提取有明显作用，如中性蛋白酶可使核仁油提取率提高20%左右，其次为纤维素酶。这可能是因为纤维素酶能降解、软化细胞壁，而蛋白酶可以降解细胞中的蛋白，增加油脂流动性，使油脂更容易从细胞中游离出来[18]。综合考虑，选择中性蛋白酶与纤维素酶的复配。

注：1.纤维素酶；2.果胶酶；3.α-淀粉酶；4.中性蛋白酶；5.碱性蛋白酶；6.木瓜蛋白酶；7.对照。图1 单一酶对山苍子核仁油提取率的影响

2.1.2 酶的复配对提取率的影响

由图2可知在料液比2 mL/g，酶解反应时间7 h，加酶量4%，pH6.0，酶解温度45 ℃的条件下，中性蛋白酶与纤维素酶质量比1∶1核仁油的提取率最高，表明该质量配比的复合酶能够有效地降解山苍子核仁的细胞壁，从而使包埋在细胞内的油脂最大程度地被释放到水中[19]。因此，复合酶选择质量比1∶1。

图2 中性蛋白酶与纤维素酶的质量比对提取率的影响

2.1.3 复合酶的用量对提取率的影响

在料液比为2 mL/g，酶解反应时间7 h，pH6.0，温度45 ℃条件下，复合酶对核仁油提取率的影响如图3所示。复合酶添加量未达3%以前，核仁油提取率随复合酶用量的增加而上升；当复合酶添加量达到3%以后，核仁油提取率达到最大并基本保持稳定。为节约实验成本，后续实验复合酶的添加量固定为3%。

图3 复合酶添加量对提取率的影响

2.2 单因素实验

在蛋白酶与纤维素酶质量比1∶1，复合酶用量3%条件下，酶解pH、液料比、酶解温度、酶解时间对山苍子核仁油提取率的影响如图4所示。

图4 单因素对山苍子核仁油提取率的影响

2.2.1 酶解pH对提取率的影响

在液料比2 mL/g，酶解反应时间7 h，温度45 ℃条件下，酶解pH对提取率的影响如图4所示。从图4可以看出在山苍子核仁油的提取率在pH3～pH6之间逐步增加，在pH6时提取率达到最高值，pH6以后提取率下降。这可能是因为复合酶存在最适pH，当时pH过高或过低时会引起复合酶酶活性降低，从而影响核仁油提取率。

2.2.2 液料比对提取率的影响

温度45 ℃， pH6.0，酶解反应时间7 h考察液料比对核仁油提取率的影响，结果见图4。液料比在3 mL/g时，核仁油提取率达到最大，继续增大液料比，核仁油提取率下降。这是因为液料比小时浆液黏度大，油脂不易分离；而液料比太大会造成酶与底物的浓度下降，影响酶的效率[20]。

2.2.3 酶解温度对提取率的影响

酶解反应pH6.0，料液比3 mL/g，酶解反应时间7 h，酶解温度对提取率的影响如图4所示。当温度在35～45 ℃时，山苍子核仁油的提取率随着温度的升高而增大；当温度上升到45 ℃时，核仁油提取率达到最高值(84.27±0.7)%；继续升高温度，复合酶的活力受到影响，核仁油提取率下降。

2.2.4 酶解时间对提取率的影响

考察酶解反应pH6.0，温度45 ℃，料液比为3 mL/g条件下，酶解时间对提取率的影响，结果如图4所示。随着酶解时间的增加山苍子核仁油的提取率逐步上升，当酶解时间达到7 h，提取率达到最大值，继续延长酶解时间，核仁油的提取率不再上升并基本保持稳定。酶解7 h后，酶解反应基本结束，继续延长反应时间蛋白质及油脂可能会在水浴振荡中乳化，因此综合考虑，后续实验固定酶解反应时间7 h。

2.3 响应面优化水酶法提油工艺

2.3.1 响应面实验设计与结果

在单因素实验的基础上，选取对酶解反应影响较大的3个因素酶解温度 (A) 、酶解pH (B) 、液料比 (C) 进行3因素3水平的响应面分析，对工艺参数进行优化。设计因素与水平编码表如表1，响应面实验设计及结果如表2所示。

表1 Box-Behnken实验因素水平

表2 响应面实验设计及结果

2.3.2 响应面优化分析

运用Design Expert8.0.6软件对实验数据进行分析处理，得到方差结果，如表3所示。

表3 响应面回归模型方差分析

Y(核仁油提取率)=86.19+1.11A+1.11B-0.48C-0.55AB+2.30AC+2.32BC-3.43A2-2.86B2-3.21C2

模型方程式中各因素对应项系数的绝对值是该因素对核仁油提取率的影响程度，由此可知影响程度：酶解pH(B)，酶解温度 (A)>液料比 (C)。

由表3可知，A、B、A2、B2、C2对响应值山苍子核仁油提取率的影响高度显著 (P<0.01) ，C不显著的原因可能是响应面考察液料比这个变量的范围较小。失拟项P>0.05，表明模型的失拟度不显著，回归系数R2为0.978 1，RPred2为0.835 6表明预测值与实验值具有良好的拟合性，校正后的复测相关系数Radj2为0.949 8，测试值与校正值较为接近，表明该模型拟程度良好[21]。

2.3.3 各因素交互作用

酶解pH(B)与液料比(C)，酶解温度(A)与液料比(C)的交互作用较强，酶解温度(A)与酶解pH(B)无交互作用。

2.3.4 回归模型的验证

根据二次回归方程的数学模型分析，得到的最佳提油工艺条件：液料比为3.11 mL/g、pH6.40、温度45.83 ℃，模型预测在此条件下山苍子核仁油的提取率能达到86.38%。为了便于实验实际操作，后期验证模型可靠性时将最佳工艺修正为液料比为3 mL/g、pH为6.40、温度46 ℃。在修正后的工艺条件下重复3次实验，得到山苍子核仁油提取率为 (86.10±0.68)%，与理论预测值相近，表明响应面所建模型有效。

2.4 山苍子核仁油的傅里叶红外分析

对水酶法最佳工艺条件下提取的山苍子核仁油进行FT-IR检测，每一个峰和肩峰在一定程度上代表分子结构和官能团或脂质组分信息，结果如图5所示。

2.5 山苍子核仁油的脂肪酸成分分析

GC-MS分析水酶法最佳工艺条件下提取的山苍子核仁油的脂肪酸组成，GC-MS图谱如图6所示，共鉴定出11种脂肪酸，相应的脂肪酸组成及含量见表4。

图6 山苍子核仁油总离子流色谱图

表4 山苍子核仁油的主要脂肪酸组成

11种脂肪酸中饱和脂肪酸5种，不饱和酸6种，与周军[24]石油醚萃取的山苍子核仁油脂肪酸组成一致。水酶法提取的山苍子核仁油除不饱和脂肪酸的质量分数30.73%高于李湘洲等[25]有机溶剂萃取的山苍子核仁油25.70%外，月桂酸含量51.92%，碳数居于10～12之间的中碳链脂肪酸等脂肪酸组成成分均无显著性差异。

3 结论

水酶法提山苍子核仁油的提取设备简单，提取效率高，对环境影响小。本研究以山苍子核仁为原料优化水酶法提油工艺，结果表明，水酶法提山苍子核仁油的最佳工艺条件为中性蛋白酶与纤维素酶质量比1∶1，复合酶添加量为3%，酶解时间7 h，液料比3 mL/g，pH6.40，温度46 ℃，在此条件下山苍子核仁油提取率可达 (86.10±0.68)%，与预测值86.38%接近。

对最佳工艺条件下提取的山苍子核仁油进行FT-IR及GC-MS分析发现：山苍子核仁油在FT-IR检测出的结构都能在GC-MS中找到对应的脂肪酸。GC-MS分析脂肪酸成分发现月桂酸质量分数为51.92%，不饱和脂肪酸为30.73%，碳数居于10～12之间的中碳链脂肪酸占68.8%，不同提油工艺提取的山苍子核仁油油脂脂肪酸成分没有明显差异，化学成分分析表明山苍子核仁油是一种具有开发潜力的天然油脂资源。