超高效液相色谱-串联质谱法快速测定大米中14种农药残留

朱 琳 张 蕊 张 冰 叶 金 王松雪王松山 郭宝元 张志军 刘鑫辉

(国家粮食和物资储备局科学研究院1，北京 100037)(吕梁学院2，吕梁 033000)

“民以食为天，食以安为先”，我国是一个人口大国，粮食安全是关系着国计民生的重大问题，尤其是新冠疫情爆发以来，更突显了粮食安全的重要性。我国是世界上最大的稻米生产国，也是最大的稻米消费国，2019年，我国水稻产量达20 961万t[1，2]。农药的使用保障了水稻生产免受病虫草害的威胁，在保障其稳产高产和品质安全中起到重要的作用，同时，农药作为一种人造化学品，其具有明显的生物学效应，对人体和环境都存在着明显的危害[3]，因此，世界各国对粮食和环境中的农药残留有严格的限定。我国的食品安全国家标准GB 2763—2019规定了34种农药及其代谢产物在大米中的残留限量[4，5]。依据国家粮食和物资储备局推动的“优质粮食工程”要求[6]，根据大米样品基质的特点，从上述34种农药中，选择14种农药残留进行了重点监测。

目前，现有农药残留检测的国标方法主要采用GPC和SPE等净化方法[7-9]，QuECHERS净化方法报道较多[10,11]，但是由于农药品种较多，其理化性质相差较大，采用现有的净化方法，难免会造成目标物的损失。随着仪器灵敏度和抗干扰能力的提升，进一步降低了仪器对样品前处理的要求，逐渐出现了样品提取液直接稀释无需净化的方法，大幅度的降低了前处理的时间和步骤，减少了前处理成本，同时也避免了复杂前处理导致的目标物损失，且适用于多目标物的同时分析[12]。本研究通过优化实验条件，建立了一种无需使用特殊净化材料，可快速检测大米中14种农药残留的超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)方法，为有效监测大米中的农药残留提供了有力的技术支持。同时，所建立的方法前处理与真菌毒素前处理基本一致[12，13]，为后续进行真菌毒素与农药残留协同监测提供了可能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米：市售，共9份样品。

农药标准品：多菌灵(carbendazim)、甲萘威(carbaryl)、异丙威(isoprocarb)、苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)、敌稗(propanil)、稻瘟灵(isoprothiolane)、禾草敌(molinate)、马拉硫磷(malathion)、喹硫磷(quinalphos)、稻丰散(phenthoate)、敌瘟磷(edifenphos)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)、丁草胺(butachlor)；甲醇、乙腈、甲酸、甲酸铵：色谱级；实验用水。

1.2 仪器与设备

6470A三重四极杆液质联用系统，1290 Infinity II液相色谱系统，H1750台式高速离心机，3-30k高速冷冻离心机，VX-III多管涡旋振荡器，WH-866旋涡混合器。

1.3 标准溶液的配置

分别用甲醇配制14种农药(多菌灵、甲萘威、异丙威、苄嘧磺隆、敌稗、稻瘟灵、禾草敌、马拉硫磷、喹硫磷、稻丰散、敌瘟磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)混合标准的储备液，于-20 ℃保存；使用空白大米提取液(按照1.4制备)将混合标准溶液逐级稀释，配制成不同浓度的基质匹配标准工作液，备用。

1.4 样品处理

样品经粉碎过40目筛后，准确称取5.00 g于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合溶剂，涡旋摇匀20 min后，以4 000 r/min离心10 min使固液分离。准确转移0.5 mL上清液于1.5 mL离心管中，加入0.5 mL去离子水稀释，涡旋混匀1 min，然后在 4 ℃下以12 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm的滤膜过滤，待测[12，13]。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱为Waters CORTECSTMUPLC C18柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)，保护柱为CORTECSTMUPLC C18柱(2.1 mm×5 mm，1.6 μm)；柱温35 ℃；进样量2 μL。流动相A为含0.1%(体积分数)的甲酸和1 mmol /L甲酸铵的水溶液，流动相B为甲醇，流速；0.4 mL/min。

梯度洗脱条件：0 min，95%A，12 min，5%A，后运行5 min。

1.5.2 质谱条件

带喷射流技术的ESI源(简称AJS)，干燥气温度为250 ℃，干燥气流速为7 L/min；鞘气温度为325 ℃；鞘气流速为11 L/min；毛细管电压为3.5 kV；DMRM正离子扫描模式；经优化后，各农残母离子及定量、 定性子离子保留时间、碎裂电压及碰撞能量见表1。

表1 14种农药残留质谱条件

2 结果与分析

2.1 大米样品农残种类

本研究选择14种(多菌灵、甲萘威、异丙威、苄嘧磺隆、敌稗、稻瘟灵、禾草敌、马拉硫磷、喹硫磷、稻丰散、敌瘟磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)农药，其主要为我国食品安全限量标准规定的大米中使用较为频繁且在液质上响应较好的农药[6-9]。

2.2 农残质谱条件的优化

在ESI源正离子模式下，对14种农残单标溶液进行母离子全扫描，再对各自子离子进行全扫描，每种农残选择2个响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对，并进行MRM及DMRM参数的优化，优化参数见表1。每种农残均以其相应的加氢的准分子离子作为特征母离子。

2.3 农残色谱分析方法的优化

通过对流动相含0.1%(体积分数)的甲酸和1 mmol/L甲酸铵的水溶液与甲醇梯度洗脱条件进行优化，以确定各农残在C18柱上的最佳分离率及检测时间，经优化，利用C18柱分离的14种农药提取离子色谱图详见图1，峰6与峰7、峰8，峰9与峰10的提取离子色谱图会有重叠，但各峰的定量离子和定性离子是不同，因此，不影响其定量分析。

2.4 农残前处理方法的选择

注：峰1：多菌灵，峰2：甲萘威，峰3：异丙威，峰4：苄嘧磺隆，峰5：敌稗，峰6：稻瘟灵，峰7：禾草敌，峰8：马拉硫磷，峰9：喹硫磷，峰10：稻丰散，峰11：敌瘟磷，峰12：甲基嘧啶磷，峰13：甲基毒死蜱，峰14：丁草胺。图1 基于UPLC-MS/MS的C18色谱柱DMRM扫描模式下14种农药提取离子(EIC)色谱图

在前期方法开发的基础上[12，13]，本研究采用直接提取稀释离心法用于大米样品中多农药的快速前处理，提高了提取效率。使用本前处理方法对大米样品进行处理，上机检测溶液澄清透明，对近百份大米基体样品进行检测，色谱柱柱压未见显著升高，方法灵敏度未发生显著下降，表明本前处理方法不会对色谱柱和质谱仪造成明显的污染，适用于大量大米样品的检测。

2.5 大米样品农残方法学验证

2.5.1 基质效应及线性范围

基质效应是基质匹配标准曲线斜率与纯溶剂配制标准曲线斜率的比值，该比值用来评估基质对质谱响应的抑制或增强效应(SSE)。该比值等于或接近1时(在0.85～1.15)，表明基质效应不明显；小于0.85时，表明存在明显离子抑制作用，大于1.15时，表明存在明显离子增强作用[13]。大米样品14种农残的基质效应及线性范围详见表2。

表2 14种农残的基质效应及线性范围

表2(续)

由表2可知，大米中14种农药基质效应及其线性关系，其中有9种农残(多菌灵、甲萘威、异丙威、苄嘧磺隆、敌稗、稻瘟灵、喹硫磷、稻丰散、敌瘟磷)未有明显的基质效应，5种农残(禾草敌、马拉硫磷、甲基嘧啶磷、甲基毒死蜱、丁草胺)有明显的基质效应，但这14种农残基质标液在线性范围内均线性相关。

因此，在进行大米样品检测时，为了提高方法的准确性，降低基质效应的影响，需采用基质匹配曲线进行定量。

2.5.2 定量限及检出限

以性噪比S/N≥10确定各农残的定量限 (LOQ)，并在定量限浓度水平进行加标回收以验证各农残的定量限(LOQ)，以性噪比S/N≥3确定各农残的检出限(LOD)。14种农残定量限和检出限详见表3。

由表3可知，有11种农药(多菌灵、甲萘威、异丙威、苄嘧磺隆、敌稗、禾草敌、马拉硫磷、喹硫磷、稻丰散、敌瘟磷、甲基毒死蜱)在1～100 μg/kg添加水平下的回收率为87.0%～115.6%，相对标准偏差为0.8%～8.7%，定量限为1 μg/kg，有2种农残(甲基嘧啶磷和稻瘟灵)在2～100 μg/kg添加水平下的回收率为91.4%～115.2%，相对标准偏差为0.5%～8.3%，定量限2 μg/kg，丁草胺在5～100 μg/kg添加水平下的回收率为89.0%～102.1%，相对标准偏差分别为0.9%～1.3%，定量限为5 μg/kg。这14种农残在相应的定量限范围内的加标回收率为87.0%～115.6%，相对标准偏差为0.5%～8.7%，检出限均小于0.4 μg/kg。由此可见，该方法不仅回收率高，精密度高，而且定量限大大低于食品安全国家标准GB 2763—2019相应农残限量的要求，因此，本方法可以满足日常检测和监测需求。

2.5.3 回收率及精密度

取空白大米样品，分别添加低、中、高三种浓度水平的混合标准溶液，按照“1.4”样品处理方法进行处理，其中，低浓度、高浓度加标水平进行3次重复实验，中浓度水平进行6次重复性实验，14种农残加标回收率及相对标准偏差结果详见表3。

表3 14种农残加标回收率、精密度及定量限、检出限及最大残留限量

2.6 大米实际样品的测定

利用开发的UPLC-MS/MS的方法对市售的9个大米样品进行测试分析，经分析可知，市售9份大米样品中有4份样品存在农药残留，占比总样品量的44%，其中多菌灵检出2份，检出率为22%，稻瘟灵检出4份，检出率为44%，其中农药残留总量最高的样品中稻瘟灵残留量为166.8 μg/kg，多菌灵留量为2.4 μg/kg，远低于GB 2763—2019规定的稻瘟灵1 mg/kg的限量，多菌灵2 mg/kg的限量。从本次市场初步筛查的结果来看，市售9份大米中14种农药均未超过食品安全国家标准GB 2763限量要求，因此，本次所采集的市售大米在农药残留方面是相对安全的，可放心食用。

3 结论

基于超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UPLC-MS/MS)技术，建立了同时检测大米中14种农药残留的方法，样品经提取、稀释、离心、过滤后直接上机，减少前处理的目标物损失，采用加标回收法验证了方法准确度和精密度，本方法14种农残加标回收率为87.0%～115.6%，相对标准偏差为0.5%～8.7%，多菌灵、甲萘威、异丙威、苄嘧磺隆、敌稗、禾草敌、马拉硫磷、喹硫磷、稻丰散、敌瘟磷、甲基毒死蜱定量限为1 μg/kg，甲基嘧啶磷和稻瘟灵定量限为2 μg/kg，丁草胺定量限为5 μg/kg，14种农残的检出限均小于0.4 μg/kg，本方法的定量限和检出限远远低于食品安全标准大米中农药最大残留限量的要求，本方法适用于大量大米样品农药残留的快速准确定量分析，同时，该方法前处理与真菌毒素前处理基本一致[12，13]，为后续建立真菌毒素与农药残留协同监测方法提供了可能，为进一步保障我国大米质量安全提供了技术保障。