甘薯块根淀粉酶特性及糖化效应研究

项 超 沈升法 吴列洪 李 兵 罗志高

(浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所，杭州 310021)

甘薯[Ipomoeabatatas(L.) Lam.]是中国重要的粮食作物[1]。近年来，随着人们生活水平的提高和对消费需求的不断改变，鲜食的消费比例持续增加，甘薯加工产品呈现多样化、营养化、细分化以及休闲食品销量逐步上升等趋势，对优质鲜食甘薯和加工专用品种的需求日益增长[2]。甘薯块根富含淀粉和淀粉酶，α-淀粉酶和β-淀粉酶是促进淀粉分解的主要酶[3,4]。其中，α-淀粉酶将淀粉分子的α-1,4糖苷键任意切断成长短不一的短链糊精及少量的麦芽糖和葡萄糖，β-淀粉酶可以从淀粉的非还原性末端降解α-1,4糖苷键，生成麦芽糖[4]。淀粉酶的活性是决定淀粉糖化程度主要因素，也是甘薯品质的重要指标之一[5]。

甘薯品种的糖化特性存在基因型差异，具体表现在淀粉率、可溶性糖含量、还原糖含量和淀粉酶活性等指标的差异[3-9]。史春余等[4]研究表明食用型品种块根膨大后期，由于淀粉酶的作用导致薯块总淀粉含量较低、可溶性总糖含量较高。陈显让等[6]研究发现在块根膨大后期，β-淀粉酶和总淀粉含量多数呈显著的负相关，可以为选择提取β-淀粉酶的优质甘薯来源提供参考。陆国权等[7]研究表明不同干率类型的甘薯品种间淀粉酶活性存在差异，高干型、低干型与中干型品种淀粉酶活性存在极显著差异。谢逸萍等[8]报道了不同基因型品种淀粉率在整个贮藏期均有所下降, 不同淀粉含量品种的淀粉酶活性存在明显差异。不同品种间块根淀粉酶活性的差异可能预示着其块根中淀粉水解所需的最低淀粉酶活性是不同的，这与淀粉糊化和相关淀粉酶活性保持条件有关[4, 10-14]。Mensah等[12]研究发现β-淀粉酶活性受温度、基因型、加热时间以及基因型与温度交互作用影响，升温和延长加热时间通常会降低β-淀粉酶的活性并导致糖分的变化。

随着鲜食甘薯消费需求和加工原料需求的变化，提前在夏季或高温季节陆续进行甘薯收获，但一般此时鲜薯糖分结累少、甜度低，其淀粉酶活性可能还不足以促进淀粉的迅速水解[4]。关于夏季或高温季节收获的甘薯淀粉酶糖化特性及不同类型内源淀粉酶活性保持条件的研究鲜有报道。因此，本实验通过测定甘薯在蒸煮熟化前后其块根中可溶性糖、还原糖含量以及不同类型淀粉酶活性变化，开展淀粉酶对甘薯淀粉的酶解特性研究，并进行生淀粉体外糖化的分析，不仅为系统了解加工过程中甘薯淀粉酶特性及糖化效应，而且为筛选鲜食或加工专用品种，有效开发甘薯资源，提高其加工产品质量、功能及其营养价值提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试甘薯材料为浙薯13、浙薯75和浙薯33；葡萄糖标准溶液(1.0 mg/mL)、硫酸铜、亚甲蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、盐酸,均为分析纯；超纯水；α-淀粉酶测定的K-CERA试剂盒、β-淀粉酶测定的K-BETA3试剂盒。

1.2 仪器与设备

C21-SK2108多功能电磁炉(蒸煮模式，1 100 W)，DKS-24恒温水浴锅，DS-1高速组织捣碎机，Eppendorf Centrifuge 5810R离心机，752紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 薯块样品处理

薯块于8月15日(夏季)收获，生育期109 d。选取3个中等大小(250 g左右)的新鲜薯块，每个薯块为一个重复，横向中间对切，其中半个薯块用电磁炉隔水蒸煮1 h，鲜薯蒸熟后冷却至室温，切除切面1 cm左右薯肉，从整个横切面均匀刮取1.0 g薯泥样品，用于熟薯糖分的测定；另外半个薯块从横切面均匀刮取两份1.0 g薯泥样品，分别用于淀粉酶及生薯糖分的测定。

1.3.2 还原糖和可溶性糖含量的测定

参照GB/T 5009.7—2016直接滴定，对生薯和熟薯样品进行还原糖和可溶性糖含量测定。取已备好的生薯和熟薯样品各1.0 g，分别加水9 mL，置于60 ℃恒温水浴中保温2 h，冷却后以1 789 g速度离心10 min，各吸取上清液6 mL，每份上清液平均分成两份，一份用于还原糖含量测定，另一份加入6 mol/L盐酸在68 ℃水解后用于可溶性糖含量测定。

1.3.3 淀粉酶活性的测定

采用K-CERA和K-BETA3试剂盒分别测定α-淀粉酶[14,15]和β-淀粉酶活性[14,16]。取1.0 g鲜薯样品，加入1 mL提取缓冲剂进行研磨，再加入4 mL提取缓冲剂分三次对研磨的鲜薯样品进行冲洗并转移到15 mL塑料离心管中，以447 g速度离心10 min，吸取上清液0.2 mL，然后加入0.2 mL α-淀粉酶测定反应底物，置于40 ℃恒温水浴中保温10 min，加3 mL终止液，在400 nm处测定吸光度值。取0.2 mL上清液，加入3 mL稀释缓冲液进行稀释，从中吸取0.2 mL溶液，然后加入0.2 mL β-淀粉酶测定反应底物，置于40 ℃恒温水浴中保温10 min，加3 mL终止液，在400 nm处测定吸光度值。其中待测酶液和底物，均事先置于40 ℃恒温水浴中保温5 min。测完后按照试剂盒提供的计算公式及稀释倍数，换算成以鲜薯计算的酶活性单位(U)。

1.3.4 淀粉酶热稳定性的测定

参考淀粉酶活性测定方法，分别测定样品在50、60、70、80、90 ℃时的酶活性，由于品种间及不同温度下酶活性差距大，需要调整适当的稀释倍数，确保吸光度在量程范围内，再按各自的稀释倍数，统一转换到淀粉酶活性测定的标准稀释倍数下的吸光度。其中β-淀粉酶热稳定性测定增加75 ℃的处理。参考淀粉酶活性测定方法，在60 、70 、75 、80 ℃条件下测定20 min内每2 min时的β-淀粉酶活性，以标准稀释倍数下的吸光度来表示。

1.3.5 生淀粉体外糖化的测定

选取3个品种的新鲜薯块，切丝后用高速组织捣碎机捣碎后，使用清水冲洗，180目筛网过滤2次，所得滤液以447 g速度离心10 min，弃上清液得到淀粉。称取新鲜湿淀粉0.20 g置于15 mL塑料离心管，加入1.3.3中的上清液0.4 mL和5 mL蒸馏水，置于75 ℃水浴锅，并控制水浴锅在15 min左右升到85 ℃，期间不断振荡离心管。达到85 ℃后迅速取出，置入冷水中冷却。以加入5.4 mL蒸馏水为对照，测定反应产生的还原糖含量，换算成以鲜薯计的还原糖含量。

1.3.6 数据统计与分析

3次重复实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，其中组间平均值比较采用Duncan分析(P<0.05)。

2 结果与讨论

2.1 β-淀粉酶活性变化

对3个甘薯品种的β-淀粉酶活性进行多因素实验的方差分析(表1)，结果表明，甘薯块根中β-淀粉酶活性高低受品种、加热温度和保温时间极显著的影响，也取决于品种和反应条件(包括温度和时间)之间的相互作用。其中，加热温度占总方差比例最大。

表1 加热温度和保温时间对不同甘薯品种块根中β-淀粉酶活性的影响

当加热温度高于酶的最适温度时，酶的活性就会逐渐失去；随着加热时间的延长，薯块中淀粉酶的失活率升高，并且这个过程是不可逆的。因此，适宜的加热温度和保温时间，在保持甘薯淀粉酶活性的稳定性方面发挥着至关重要的作用。温度对β-淀粉酶活性的影响由图1所示，3个甘薯品种的β-淀粉酶活性在不同温度条件下变化趋势基本一致，变化的程度有所不同。当温度低于60 ℃时，β-淀粉酶活性随温度的升高而增大；当温度高于60 ℃时，β-淀粉酶活性随着温度的升高呈下降趋势。供试品种在60 ℃温度条件下可以较好地保持甘薯淀粉酶活性，与前人研究结果基本一致[14,17]。β-淀粉酶不能水解天然淀粉，能水解糊化的甘薯淀粉[14]。本研究中β-淀粉酶在75 ℃和80 ℃仍有较强的活性，80 ℃时其糖化能力已经大大降低，说明其不能耐受80 ℃以上的高温。在70～90 ℃范围内，浙薯13的β-淀粉酶活性下降幅度显著小于浙薯33，与浙薯75无显著差异；说明浙薯13的β-淀粉酶热稳定性较强。当反应温度一定时，在保温时间在20 min以内时，β-淀粉酶活性总体上都是随保温时间延长而增大；当温度高于60 ℃时，糖化速度随保温时间的延长呈下降趋势，β-淀粉酶活性趋于平稳(图2)。另外，对3个甘薯品种之间比较分析发现，浙薯33的淀粉酶活性在同样反应条件下最高，浙薯13次之，浙薯75最低。与保温时间和品种两个因素相比，温度是影响β-淀粉酶活性的主要因素。因此，在甘薯蒸煮食用及其产品加工过程中应严格控制加热的温度。

图1 不同温度条件下β-淀粉酶活性变化

图2 不同温度及不同加热时间处理对三个品种甘薯β-淀粉酶热稳定性的影响

3个甘薯品种中，浙薯13和浙薯33能够很好地保持其中的淀粉酶活性，浙薯13的耐热性更强。浙薯13和浙薯33因含有相对较高的β-淀粉水解潜力使其成为薯脯干加工的良好原料。

2.2 α-淀粉酶活性变化

方差分析结果表明，甘薯块根中α-淀粉酶活性不仅受品种和加热温度极显著的影响，而且受品种与加热温度之间互作效应极显著的影响(表2)。其中，加热温度占总方差比例最大。与品种相比，加热温度是影响α-淀粉酶活性的主要因素。温度对α-淀粉酶活性的影响由图3所示，α-淀粉酶活性随温度的升高而下降；当温度高于50 ℃时，其糖化能力已经大大降低；在50～70 ℃范围内，3个品种的α-淀粉酶活性均大幅下降，其中浙薯13的α-淀粉酶活性下降幅度最小且显著低于浙薯75，与浙薯33下降幅度无明显差异。当温度超过80 ℃时，酶开始变性失活，从而抑制了糖化反应的进行。3个甘薯品种的α-淀粉酶活性在不同温度条件下变化趋势基本一致，变化的程度有所不同。对图1和图3的结果进行比较可以发现，各品种块根中α-淀粉酶活性都远低于β-淀粉酶活性，这与前人的研究结果一致。

表2 加热温度对不同甘薯品种块根中α-淀粉酶活性的影响

图3 不同温度条件下α-淀粉酶活性变化

2.3 还原糖、可溶性糖含量变化

β-淀粉酶催化可溶性淀粉向糖的转化，从而增加了游离糖的组成和加工产品的甜度[12]。从图4可以看出，不同品种在蒸煮之后的可溶性糖和还原糖含量均显著增加，且还原糖含量的增幅较可溶性糖含量更大。不同品种间熟薯可溶性糖含量和还原糖含量均存在显著差异；可溶性糖含量和还原糖含量的增量和增幅均是浙薯33最大，浙薯13次之，浙薯75最小。以上结果可以推断，甘薯蒸煮过程中，达到淀粉糊化温度后，β-淀粉酶仍存在较大活性，对糊化淀粉的糖化作用导致甘薯蒸煮过程中糖分的变化[5,18-20]。进一步的生淀粉体外糖化实验证明，在75～85 ℃条件下，以还原糖含量为指标，含β-淀粉酶的甘薯提取液能使生淀粉在糊化的同时实现糖化。β-淀粉酶活性高的品种，其糖化产率，即还原糖含量也相应较高。夏季或高温季节进行甘薯收获时，鲜薯糖分结累少，甜度低，而β-淀粉酶能在蒸煮过程中大幅度增加糖分，因此选择β-淀粉酶活性高、热稳定性好的品种，适合夏季收获，作为鲜食或加工品种应用。

注：同一类型的糖分柱上不同字母的表示处理间差异显著(P<0.05)。图4 不同品种蒸煮前后糖分变化

注：不同字母的表示处理间差异显著(P< 0.05)。图5 生淀粉体外糖化结果

在适宜条件下，α-淀粉酶随机作用于淀粉链内部的α-1,4-糖苷键，产物是糊精及少量的麦芽糖和葡萄糖；β-淀粉酶可以从淀粉的非还原性末端降解α-1,4-糖苷键，生成麦芽糖[4]。基于以上作用机理，Mensah等[12]的实验结果表明，α-淀粉酶和β-淀粉酶水解淀粉存在很好的协同作用。甘薯块根中含有一定量的α-淀粉酶，在高温下，它的存在可能增强了淀粉向麦芽糖的转化，而升温和增加加热时间通常会降低β-淀粉酶的活性并增强麦芽糖的形成[10]。本研究中β-淀粉酶的最佳温度在60 ℃左右，加热到75 ℃仍可保留相对较高比例的内源淀粉酶[12,21]。因此，较高温度下还原糖含量的差异可能是由于α-淀粉酶和β-淀粉酶的协同作用。

3 结论

甘薯块根中β-淀粉酶活性受品种、加热温度和保温时间极显著的影响；与保温时间和品种这两个因素相比，温度是影响β-淀粉酶活性的主要因素。甘薯块根中α-淀粉酶活性受品种、加热温度以及两者之间互作效应极显著的影响；与品种相比，加热温度是影响α-淀粉酶活性的主要因素。因此，在甘薯蒸煮食用及其产品加工过程中应严格控制加热的温度。3个甘薯品种中，浙薯13和浙薯33能够很好地保持其中的β-淀粉酶活性，浙薯13的耐热性更强。β-淀粉酶活性高的品种，其糖化产率也相对较高。甘薯品种浙薯13和浙薯33因含有相对较高的β-淀粉水解潜力和耐热性，适合在夏季或高温季节收获作为鲜食和加工的良好原料。